[发明专利]一种用于脂肪干细胞的冻存前处理方法

权利要求书

1.一种用于脂肪干细胞的冻存前处理方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：PBS缓冲液洗涤脂肪组织后进行第一次离心，获取中层组织，将所述中层组织悬浮于I型胶原酶溶液,之后进行震荡，再进行第二次离心，吸掉上清，得到二次离心细胞微球；

步骤2：将所述步骤1所述二次离心细胞微球悬浮于PBS缓冲液，之后进行过滤，取滤液得到过滤后细胞液，将所述过滤后细胞液中加入培养基进行重新悬浮，得到二次重悬细胞液；

步骤3：将所述步骤2中所述二次重悬细胞液中的细胞接种于培养瓶中，无红细胞裂解过程；

步骤4：将所述步骤3培养瓶中细胞培养到第二代时，得到第二代细胞培养液，对所述第二代细胞培养液进行第三次离心，去掉上清后，加入冻存剂，得到终末细胞液，在室温下将所述终末细胞液放入慢速降温冻存盒后置于冰箱，最后将所述冰箱内的所述冻存盒转移至液氮罐保存。

2.根据权利要求1所述一种用于脂肪干细胞的冻存前处理方法，其特征在于，所述步骤1中所述PBS缓冲液PH值为7-7.5，所述洗涤次数为3次，所述第一次离心速率为1200rpm,所述第一次离心时间为5min，所述I型胶原酶溶液的质量浓度为0.02％，所述I型胶原酶溶液用量与所述脂肪组织的体积相同。

3.根据权利要求2所述一种用于脂肪干细胞的冻存前处理方法，其特征在于，所述步骤1中所述振荡温度为37℃，所述震荡速率为100rpm，所述震荡时间为60min,所述第二次离心速率为1200rpm，所述第二次离心时间为10min。

4.根据权利要求3所述一种用于脂肪干细胞的冻存前处理方法，其特征在于，所述步骤2中所述PBS缓冲液PH值为7-7.5，所述PBS缓冲液体积与所述脂肪组织的体积相同，所述过滤孔径直径为100μm。

5.根据权利要求4所述一种用于脂肪干细胞的冻存前处理方法，其特征在于，所述步骤2所述培养基为包含体积分数为90％胎牛血清和体积分数为1％青链霉素的低糖DMEM培养基，所述培养基的体积与所述脂肪组织的体积相同。

6.根据权利要求5所述一种用于脂肪干细胞的冻存前处理方法，其特征在于，所述步骤3中所述培养瓶规格为225cm²，所述培养温度为37℃，所述培养环境的CO2体积分数为5％。

7.根据权利要求6所述一种用于脂肪干细胞的冻存前处理方法，其特征在于，所述步骤3中所述培养过程为在培养48小时后首次换液，之后每3天换液1次，在细胞80％融合时用胰蛋白酶替代物消化传代。

8.根据权利要求7所述一种用于脂肪干细胞的冻存前处理方法，其特征在于，所述步骤4中所述冻存剂配比为体积分数占90％的胎牛血清和体积分数占10％的DMSO，所述步骤4中所述第三次离心速率为1200rpm，所述第三次离心时间为5min。

9.根据权利要求8所述一种用于脂肪干细胞的冻存前处理方法，其特征在于，所述步骤4中所述终末细胞液浓度为5×10⁶/ml。

10.根据权利要求9所述一种用于脂肪干细胞的冻存前处理方法，其特征在于，所述步骤4中所述冻存盒为Nalgene梯度降温冻存盒或者具有慢速降温功能的容器，所述冰箱温度为-80℃，所述终末细胞液在所述冰箱内的存放时间为12h。