[发明专利]一种大量提取转化粪便DNA的方法

说明书

本发明公开了一种大量提取转化粪便DNA的方法。首先将1～5g粪便收集到含保护液管中，加入裂解液充分裂解，再除去抑制剂，用有机溶剂沉淀核酸，通过重悬沉淀获得核酸，用于核酸提取或核酸转化，通过一系列结合洗涤步骤，最后洗脱得到粪便DNA。本发明包含粪便DNA的提取、转化和提取转化合并的方法。具有成本低、利用率高、重复性好、简单快速的特点，能得到大量粪便DNA或转化后的粪便DNA，为转化或下游的检测提供了更多可能性。

技术领域

本发明涉及一种大量提取转化粪便DNA的方法。

背景技术

大肠癌包括结肠癌与直肠癌，是常见的消化道恶性肿瘤，发生率仅次于胃癌和食道癌，已高居世界恶性肿瘤第3位病死率第4位。有资料显示早期大肠癌术后5年存活率高达90％，而晚期大肠癌术后5年存活率只有10％，因此大肠癌的早筛显得尤为重要。目前早筛查措施主要包括粪便潜血实验，钡灌肠检查、肠镜检查等，但是肠癌早期无明显症状且缺乏高灵敏度和强特异性的早期诊断技术，大部分患者被确诊时已是肠癌中晚期，失去了最佳的治疗时机，因此建立早期肠癌无损伤快速诊断方法成为了当前医学界重点攻克难题。

研究表明，正常人的粪便每天大约可排泄约10¹⁰个上皮细胞，提取脱落到粪便里的结肠黏膜细胞的DNA，再通过转化技术，将未甲基化的胞嘧啶高效转化成尿嘧啶，最后检测基因启动子区的一段甲基化序列是否发生甲基化，是一种理想的早期结直肠癌筛查手段。

粪便样品获得比较容易，而且不会对病人造成任何的痛苦和不便。另外使用样本量少，取样过程非常方便且对病人无任何影响。但是目前应用于临床诊断还有诸多困难需要解决，比如采集和分离过程中存在DNA酶的降解，各种抑制剂的存在导致从粪便里提取出的人类粪便DNA量很少或提取的DNA难以用于PCR扩增。

目前市面上，已有相关粪便DNA提取方法，但是提取获得的粪便DNA量少或DNA难以用于PCR扩增，另外存在操作繁琐且价格昂贵；也已有相关粪便DNA转化方法，但是存在转化效果不稳定、操作繁琐且价格昂贵等诸多缺点；另外，传统方法对于粪便DNA提取与转化是分两个阶段完成，存在DNA损耗大、利用率低、操作繁琐且价格昂贵等诸多缺点，很难满足下游的分子诊断需求。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种大量提取转化粪便DNA的方法，可为下游的检测提供更多可能性。

本发明解决其技术问题的所采用的技术方案是：

技术方案一：

一种大量提取粪便DNA的方法，包括以下步骤：

1.取5～35mL Buffer SPB至离心管中，所述Buffer SPB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、50～500mM NaCl、10～70％无水乙醇，再取1～5g粪便样本至管中，充分振荡混匀；

2.先加入50～1000μL Buffer SLS，所述Buffer SLS包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、10～20％SDS，颠倒混匀，再加入50～500μL蛋白酶K，颠倒混匀后置恒温水浴锅56～75℃水浴5～30min；

3.将离心管转至室温水浴1～5min，8000～12000g离心1～3min；

4.取2～6mL上清于新的离心管中，加入1～2mL Buffer SDL，所述Buffer SDL包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、0.5～5％PVP10和0.5～3.5M醋酸钠，上下颠倒混匀，8000～12000g离心1～3min；

5.取全部上清于新的离心管中，再加2～5mL有机溶剂，上下颠倒混匀，10000～14000g离心5～15min，弃上清；