[发明专利]一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法

说明书

本发明公开了一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法，包括以下步骤：(1)设计特异性引物与探针；(2)优化荧光定量PCR反应体系和反应条件；(3)提取含有目的序列的质粒标准品，作为荧光定量PCR阳性模板，进行荧光定量PCR扩增，获得扩增曲线和标准曲线；(4)提取待测样品的病毒RNA，进行荧光定量PCR扩增，检测所提取病毒是否为传染性肌肉坏死病毒阳性。本发明以全基因组的5’‑3’的第835个碱基至第901个碱基为目的序列，设计特异性引物和探针，检测灵敏度高、特异性强，且检测结果的重复性高，准确可靠，对操作人员技术要求低，易于实现标准化，尤其适用于出入境对虾的检疫。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法。

背景技术

水产养殖是指在人为控制的条件下繁养、培育并且收获水生动植物的生产活动。病毒性疾病是水产养殖中影响产量的重要因素，密集和多样的养殖方式使得许多病毒有了可乘之机，传染性肌肉坏死病毒(IMNV)就是其中之一，南美白对虾是已知IMNV的最易感虾种，在生长的各个阶段均可被感染。该病第一次于2002年出现于巴西的凡纳滨对虾养殖厂，2006年传入印度尼西亚，感染虾出现体色发白、腹节发红、尾部肌肉组织呈点状或扩散状，体表有不规则黑斑的症状，死亡率在40％～70％不等。

IMNV为双链RNA病毒，主要侵染南美白对虾的横纹肌组织，检测手段是发现感染性疾病的方法之一，针对该病毒核酸序列的研究使建立灵敏、特异的检测方法、发展有效的治疗措施成为可能。IMNV病毒核酸为双链不分节段的RNA，不同株的总核苷酸数有些许差别，但大约为8226-8230bp，具有两个不重叠的开放阅读框(ORF)，ORF1编码RNA结合蛋白、主要衣壳蛋白，ORF2编码RNA依赖的RNA聚合酶，是相对保守的区域。截止到目前为止，GenBank中共有该病毒的序列共有18个结果，其中NC-007915与AY570982相同，全基因组序列7个，10个IMNV的部分基因序列。

IMNV的检测方法包括免疫学检测方法和以核酸为基础的检测方法，免疫学检测方法的原理是利用特异的抗原抗体反应来检测病毒的方法，不同于病毒的分离培养，免疫学的方法用时短，不需要特定的实验室条件，可以发展为商品化的试剂盒，方便快捷，适合于塘边检测。以核酸为基础的检测方法由于高灵敏度和高特异性的特点，已经广泛用于实验室检测。目前我国尚未报道IMNV感染对虾的案例，但随着经济全球化进程的不断深入，跨境交流越来越频繁，外来疫病的传入的风险也随之扩大，控制风险的主要方式是加强入境动物的检疫，准确、灵敏、重复性好，且易于标准化的检测方法是出入境对虾检疫所迫切需要的。现有IMNV的荧光定量PCR检测方法将研究重点放在灵敏度和特异性上，而忽略了重复性，重复性差导致无法获得准确的检测结果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法，该检测方法设计特异性引物和探针，检测灵敏度高、特异性强，且检测结果的可重复性高，对操作人员技术要求低，易于实现标准化。

本发明采用的技术方案如下：

一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法，包括以下步骤：

(1)引物设计：查找GenBank中的传染性肌肉坏死病毒的全基因序列，以全基因组的5’-3’的第835个碱基至第901个碱基为目的序列，使用Primr premier软件设计特异性引物与TaqMan探针，序列如下，方向5’→3’：

正向引物：GAAGCCTAAATACACATCGAC；

反向引物：CTGCTTCGCTAAAACCTG；

探针：AAAACCGGAGCTGACCAC，5’端用Fam标记，3’端用BHQ-1标记；

(2)优化荧光定量PCR反应体系和反应条件；