[发明专利]一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法

权利要求书

1.一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)引物设计：查找GenBank中的传染性肌肉坏死病毒的全基因序列，以全基因组的5’-3’的第835个碱基至第901个碱基为目的序列，使用Primr premier软件设计特异性引物与TaqMan探针，序列如下，方向5’→3’：

正向引物：GAAGCCTAAATACACATCGAC；

反向引物：CTGCTTCGCTAAAACCTG；

探针：AAAACCGGAGCTGACCAC，5’端用Fam标记，3’端用BHQ-1标记；

(2)优化荧光定量PCR反应体系和反应条件；

(3)提取含有目的序列的质粒标准品，作为荧光定量PCR阳性模板，进行质粒浓度检测，计算出重组质粒的拷贝数，以10倍稀释度将质粒进行倍比稀释，将其作为标准质粒模板，并设立无模板对照，进行荧光定量PCR扩增，获得扩增曲线和标准曲线；

(4)提取待测样品的病毒RNA，进行荧光定量PCR扩增，检测所提取病毒是否为传染性肌肉坏死病毒阳性。

2.根据权利要求1所述的一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，荧光定量PCR反应体系为：反应总体积25μL，其中Probe qPCRSuperMix 12.5μL、RNase Free Water 7.5μL、正向引物1μL、反向引物1μL、探针1μL、模板2μL。

3.根据权利要求2所述的一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的条件为：94℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火延伸1min，40个循环。

4.根据权利要求1所述的一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中，荧光定量PCR反应体系为：反应总体积为25μL，其中2*OneStep RT-PCR Buffer III12.5μL、TaKaRaEx Taq HS 0.5μL、PrimeScript RT Enzyme MIXII 0.5μL、正向引物1μL、反向引物1μL、探针0.7μL、ddH₂0 6.8μL，模板2μL。

5.根据权利要求4所述的一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的条件为：42℃预变性5min，95℃变性10s，95℃退火10s，60℃延伸1min，40个循环。

6.根据权利要求1所述的一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将质粒标准品稀释成10⁸-10¹拷贝/μL的8个浓度梯度作为标准质粒模板。

7.根据权利要求1所述的一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，采用ddH₂O作为无模板对照。

8.根据权利要求1所述的一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，含有目的序列的质粒标准品为：使用步骤(1)中的特异性引物扩增出目的序列，将目的序列连入pUC57-simple载体，然后转化到大肠杆菌中进行扩繁，从大肠杆菌中提取所需含有目的序列的质粒标准品。