[发明专利]一种采用快速免疫磁珠法分离脑脊液中不同细胞来源外泌体亚型的方法

说明书

本发明涉及一种采用快速免疫磁珠法分离脑脊液中不同细胞来源外泌体亚型的方法，具体步骤包括：(1)对脑脊液进行预处理；(2)加入PE标记的一抗进行分选；(3)加入免疫磁珠；(4)增加磁场，进行分离。与现有技术相比，本发明精准分离中枢神经系统不同细胞来源的外泌体亚群，可供针对性的对中枢疾病以及不同靶细胞外泌体深入研究。

技术领域

本发明涉及一种分离纯化方法，尤其是涉及一种采用快速免疫磁珠法分离脑脊液中不同细胞来源外泌体亚型的方法。

背景技术

免疫磁珠法分离外泌体是基于外泌体表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的外泌体被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的外泌体由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使表达特定标志物的外泌体亚型得以分离。

外泌体是一种由细胞主动分泌到胞外的囊泡小体，直径为30-100nm，携带有来源细胞的多种蛋白和RNA成分，可作为细胞间信息交流和物质传递的媒介。神经元是构成神经系统结构和功能的基本单位，星形胶质细胞是中枢数量最多、承担重要的代谢和支持功能的细胞，小胶质细胞是中枢最重要的免疫细胞，可被多种刺激和疾病状态激活。神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞是中枢系统三种主要的细胞，均可产生外泌体，释放入脑脊液或者血液。外泌体是具有生物活性的微囊泡，可被周围细胞摄取，进行细胞间物质传递和信息交流。近年来研究发现，多种中枢疾病发病过程中外泌体参与中枢疾病的进程，比如脑内炎症性疾病，小胶质细胞激活后大量释放的外泌体参与疾病进展；神经退行性疾病中，比如阿尔兹海默病，神经元细胞释放内含有参与异常蛋白a-β的多聚体的外泌体，并参与a-β的传播。因此，脑脊液中不同细胞来源的外泌体的表达分泌情况可作为中枢疾病评估的依据。目前，脑脊液外泌体分离主要有超速离心法，梯度密度离心法，超滤法，层析法，大分子聚合物沉降法，免疫磁珠试剂盒法等。超速离心法要求样品体积大(mL-L级别)，虽然对外泌体得率较高，但耗时耗力(超过2小时)。市面上常用的外泌体分离试剂原理为大分子聚合物沉淀法，提取外泌体耗时短，但缺点是产物外泌体纯度低，掺杂混杂蛋白和盐份。超滤法只能将直径小于滤膜孔径的囊泡分离出来，也会导致产物不纯。更重要的是，以上所述技术均只能分离脑脊液中的总外泌体，无法对特定亚群的外泌体(比如小胶质细胞来源的CD11b+外泌体)的分离，当然也就无法实现使用特定细胞来源外泌体亚群反映疾病程度的目的。在精准医学不断发展的今天，根据不同细胞来源对外泌体进行精准分型成为迫切需要解决的问题，这一要求，也是外泌体液体活检开发进步以及应用于临床的第一步。免疫磁珠捕获可对特定表达某种标志物蛋白的外泌体进行结合，经洗脱后可以准确区分外泌体亚型和细胞来源。但该项技术目前仍然不成熟，目前没有可以直接应用于脑脊液的外泌体亚型分选磁珠。发明内容针对现有技术的缺陷，目的在于提供一种操作简单快速且成本较低，能精准分离中枢主要的三种细胞来源(特异性表达小胶质细胞CD11b+、神经元Neun、星形胶质细胞GFAP)外泌体分离方法。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种采用快速免疫磁珠法分离脑脊液中不同细胞来源外泌体亚型的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种采用快速免疫磁珠法分离脑脊液中不同细胞来源外泌体亚型的方法，包括以下步骤：

(1)将脑脊液离心分离，去除细胞碎片等杂质，取上清加入外泌体沉降抽提试剂后，混匀，孵育过夜，离心去掉上清液后，重悬，得到脑脊液样本；

(2)在步骤(1)得到的脑脊液样本中加入PE标记的一抗，孵育后，加入外泌体分选试剂，混匀孵育，得到脑脊液标记样本；

(3)将PE包被的磁珠震荡混匀，加入步骤(2)得到的脑脊液标记样本，混匀后孵育，得到混合样本；

(4)将混合样本洗涤、吹打、置于磁场中，翻转后弃掉上清液；