[发明专利]一种鸡白痢沙门氏菌检测试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种鸡白痢沙门氏菌检测试剂盒，其特征在于，它包含：鸡白痢沙门氏菌特异引物、16S通用引物、沙门氏菌属特异引物、PCR缓冲液、PCR enhancer、dNTP、DNA聚合酶Tfl和DNA聚合酶KOD；

所述鸡白痢沙门氏菌特异引物的序列如SEQ ID NO.11-12所示；

所述16S通用引物的序列如SEQ ID NO.17-18所示；

所述沙门氏菌属特异引物的序列如SEQ ID NO.3-4所示；

所述PCR缓冲液含有200-260摩尔份的Tris-HCl、4-8摩尔份的MgCl₂、50-120摩尔份的(NH₄)₂SO₄、90-110摩尔份的KCl和1-3体积份Triton X-100；所述PCR enhancer含有2500-2800摩尔份甜菜碱、6-7.5摩尔份二硫苏糖醇、65-70体积份的DMSO和50-60质量份的BSA；

所述试剂盒是将鸡白痢沙门氏菌CVCC533与肠炎沙门氏菌CVCC3377、鼠伤寒沙门氏菌CVCC2222、大肠杆菌JM-109、大肠杆菌BL-21、大肠杆菌JM-CPR、大肠杆菌DH-5α、大肠杆菌S17-1相区分的试剂盒。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液含有240摩尔份的Tris-HCl、4摩尔份的MgCl₂、110摩尔份的(NH₄)₂SO₄、100摩尔份的KCl和2体积份Triton X-100。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液是2倍浓度的缓冲液，其中含有：Tris-HCl 240mM、MgCl₂ 4mM、(NH₄)₂SO₄ 110mM、KCl 100mM、Triton X-100 0.2%(v)。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR enhancer含有2700摩尔份甜菜碱、6.7摩尔份二硫苏糖醇、67体积份的DMSO和55质量份的BSA。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR enhancer是5倍浓度的浓缩液，其中含有：甜菜碱 2.7M、二硫苏糖醇 6.7mM、DMSO 6.7%（v）、BSA 55μg/mL。

6.一种非疾病诊断目的的将鸡白痢沙门氏菌CVCC533与肠炎沙门氏菌CVCC3377、鼠伤寒沙门氏菌CVCC2222、大肠杆菌JM-109、大肠杆菌BL-21、大肠杆菌JM-CPR、大肠杆菌DH-5α、大肠杆菌S17-1相区分的方法，其特征在于，它包含如下步骤：

1）获取待检样本DNA或经煮沸处理的样本上清液；

2）使用如权利要求1~5任意一项所述试剂盒组分进行三重PCR扩增，其反应条件是：95℃预变性5-10min后，94℃变性30-40s、56℃退火15-30s、72℃延伸80-100s，共30-45个循环；

3）凝胶电泳检测；

步骤2）中三对引物浓度比为沙门氏菌属特异引物∶鸡白痢沙门氏菌特异引物∶16S通用引物= 1∶0.5∶1；采用的三对引物为鸡白痢沙门氏菌特异引物、16S通用引物和沙门氏菌属特异引物；

鸡白痢沙门氏菌特异引物的序列如SEQ ID NO.11-12所示；16S通用引物的序列如SEQID NO.17-18所示；沙门氏菌属特异引物的序列如SEQ ID NO.3-4所示；

步骤2）中DNA聚合酶浓度比为Tfl∶KOD=(1-30)∶1。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2）所述的反应条件为：95℃预变性5min后，94℃变性30s、56℃退火15s、72℃延伸80s，共30个循环。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2）所述的DNA聚合酶浓度比为Tfl∶KOD=10∶1。