[发明专利]一种正确折叠的重组狂犬病毒G蛋白胞外段及其潜在应用

说明书

本发明公开了一种正确折叠的重组狂犬病毒G蛋白胞外段及其潜在应用，属于蛋白质工程和生物制品技术领域。本发明将狂犬病毒G蛋白胞外段中的融合环替换为柔性的连接肽，实现了狂犬病毒G蛋白胞外段的可溶和分泌表达，并成功制备得到了溶液中性质均一的蛋白，该方法在疫苗制备、中和抗体筛选以及用作诊断试剂盒和疫苗抗原含量标定的标准品等方面均具有重要的潜在应用价值。

技术领域

本发明涉及一种正确折叠的重组狂犬病毒G蛋白胞外段及其潜在应用，属于蛋白质工程和生物制品技术领域。

背景技术

狂犬病毒(rabies virus,RABV)，又称为传统狂犬病毒，是目前造成绝大多数人类狂犬病的致病原，属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)、狂犬病毒属(Lyssavirus)。狂犬病毒呈子弹状结构，直径约75-80nm，长度约170-180nm，为有囊膜包被的RNA病毒。其基因组为单股、负链、不分节段的RNA，大小约12kb，编码N(核蛋白)、L(转录复制酶蛋白)、P(磷酸化蛋白)、G(糖蛋白)和M(基质蛋白)共计五个蛋白。其中，糖蛋白(glycoprotein,G)是病毒囊膜中的唯一蛋白组分，其属于I型跨膜蛋白，成熟蛋白以三聚体形式定位于病毒囊膜中，形成约8-10nm的病毒刺突或棘突；在成熟的狂犬病毒粒子表面，约分布有300-400个这样的G蛋白刺突分子，占病毒总蛋白含量的40％以上。

狂犬病毒G蛋白(rabies virus glycoprotein,RABV-G)作为病毒囊膜中的唯一蛋白组分，是介导病毒对宿主细胞表面受体识别的唯一分子，也是行使膜融合功能介导病毒侵入的唯一病毒组分，因此，在病毒致病中发挥决定性作用。同时作为唯一暴露于病毒表面的病毒蛋白，狂犬病毒G蛋白还是病毒中和抗体的唯一靶点，是狂犬病毒疫苗的最重要抗原组分。鉴于狂犬病毒G蛋白的重要作用，具有良好理化性质的狂犬病毒G蛋白即可被用于疫苗制备和中和抗体筛选，也可被用作疫苗抗原含量标定的标准品等，具有重要的潜在应用价值。

狂犬病毒G蛋白全长按其氨基酸序列组成，由N-端到C-端分别包括信号肽(signalpeptide)、胞外段(ecto-domain)、跨膜区(transmembrane domain)和胞内段(cytoplasmicdomain)共四个功能区段，其中，胞外段是真正暴露于病毒粒子表面的G蛋白区段，是行使受体识别和膜融合的真正功能区段，也是疫苗制备中真正有效的抗原区段以及中和抗体的真正靶点。因此，如何实现体外制备具有良好理化性质且具有正确折叠的狂犬病毒G蛋白胞外段具有重要意义。

目前对狂犬病毒G蛋白表达制备的研究报道按其重组表达宿主的不同可大致分为四类：

1.利用原核蛋白表达系统(通常为工程大肠杆菌)表达G蛋白。通常将G蛋白全长或G蛋白胞外段自身直接在工程大肠杆菌中表达，或者将其与融合标签(如GST、SUMO等)融合后在工程大肠杆菌中表达。前者往往为不可溶的蛋白包涵体形式，或者仅极少量的蛋白可溶表达；后者虽然可以增加G蛋白的可溶表达比例，但是其融合标签往往难以切除，且蛋白虽然可溶，但其溶液中的均一性很差，在分子排阻层析中为空体积洗脱，证明其以无规则的多聚体形式存在。代表性的此类狂犬病毒G蛋白表达纯化研究可参考文献(1)。

2.利用酵母细胞表达G蛋白。通常将狂犬病毒G蛋白在毕赤酵母中进行表达。针对此类G蛋白的表达制备方法，虽然通过表达条件优化等，能在一定程度上实现蛋白的可溶和分泌表达，但其分泌表达量低。而尤其需要注意的是，此类利用酵母细胞表达狂犬病毒G蛋白的研究中，所表达的蛋白均未进行有效的纯化，因此均是通过western blot的方法进行蛋白检测；同时均缺少利用分子排阻层析、离子交换层析等层析方法对蛋白性质进行研究的数据，所表达的G蛋白在溶液中的理化性质等均未知。代表性的此类狂犬病毒G蛋白表达纯化研究可参考文献(2)。