[发明专利]一种血浆中militarine及其代谢物的定性定量分析方法

权利要求书

1.一种血浆中militarine及其代谢物的定性定量分析方法，其特征在于：包括采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱仪对militarine入血后的原型成分及其代谢物进行分析鉴定，确定血浆中原型成分为militarine，代谢产物为gymnoside I、gastrodin、α-isobutylmalic；采用高效液相色谱-电喷雾-串联质谱仪，以葛根素为内标物，对口服militarine后血浆中的原型成分及其代谢物gymnoside I、gastrodin、α-isobutylmalic进行含量测定；血浆中militarine及其代谢物分析鉴定的大鼠口服给药及血浆样品处理方法包括以下步骤：选择生长状态相似的健康SD大鼠；动物随机分为空白组和药物组；给药前禁食不禁水12h；药物组经尾静脉注射militarine 30mg/kg，空白组大鼠静脉注射等量生理盐水；于给药后0.5、1、1.5、2、3、4h经尾静脉取血约0.5mL，置涂有肝素的塑料离心管中；6000r/min离心6min后分离血浆，等量混合各时间点血浆；取混合后的血浆2mL，用5倍量甲醇沉淀蛋白，离心后得到上清液，37℃N₂吹干；残留物用200μL 50％甲醇水溶液溶解，涡混1min，超声10min，4℃、12000r/min离心10min，取上清液供UPLC-Q-TOF MS检测分析；

血浆中militarine及其代谢物分析鉴定的UPLC-Q-TOF MS色谱条件包括：色谱柱：Waters BEH C18柱，2.1mm×50mm,1.7μm；流动相：0.01％甲酸水溶液A-0.01％甲酸乙腈B，梯度洗脱：0～2min，5％B，Curve：initial；2～5min，5％～15％B，Curve：6；5～8min，15％～15％B，Curve：1；8～10min，15％～45％B，Curve：6；10～14min，45％～95％B，Curve：6；14～15min，95％～5％B，Curve：1；流速：0.5mL/min；柱温：35℃；进样体积：1μL；

血浆中militarine及其代谢物分析鉴定的UPLC-Q-TOF MS质谱条件包括：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；毛细管电压：1.5kV；离子源温度：100℃；锥孔电压：30V；脱溶剂气温度：300℃；锥孔气流量：50L/h；碰撞能量：20-30 V；脱溶剂气流量：10L/min；数据采集模式：MSE Continuum；甲酸钠校正；校正模式：sensitivity；质谱数据采集及处理软件为：Masslynx V4.1工作站；扫描方式：MS Centroid模式；

血浆中militarine及其代谢物HPLC-ESI-MS/MS含量测定的色谱条件包括以下步骤：色谱柱：ACE UltraCore Super C18柱，2.1mm×100mm，2.5μm，流速：0.20mL·min^-1，柱温：45℃，进样器的温度：25℃，进样体积为1μL，流动相：0.1％甲酸乙腈-0.1％甲酸水，按下表中的规定进行梯度洗脱；

血浆中militarine及其代谢物HPLC-ESI-MS/MS含量测定的质谱条件包括以下步骤：电喷雾电离源，正、负模式同时扫描，毛细管电离电压：3kV，离子源温度：120℃；喷雾气与反吹气：N₂，去溶剂气流速：650L·hr^-1，去溶剂气温度：350℃，扫描方式为选择离子监测，质谱数据采集及处理软件为Analyst、MultiQuant工作站；militarine及其3种代谢物和内标物葛根素用于定量分析的监测离子见下表：

2.根据权利要求1所述的血浆中militarine及其代谢物的定性定量分析方法，其特征在于：血浆中militarine及其代谢物HPLC-ESI-MS/MS含量测定的大鼠口服给药方法包括以下步骤：取SD大鼠，雌雄各半，禁食12h，自由饮水；militarine口服给药剂量为60mg/kg，于给药前及给药后0.033，0.083，0.167，0.33，0.5，1，1.5，2，4，6，8，12，24，36h进行颈静脉插管取血约0.3mL，置涂有肝素的塑料离心管中；6000r/min离心6min后分离血浆，-20℃冰箱中保存，直至分析。

3.根据权利要求1所述的血浆中militarine及其代谢物的定性定量分析方法，其特征在于：血浆中militarine及其代谢物HPLC-ESI-MS/MS含量测定的血浆样品处理方法包括以下步骤：取大鼠血浆100μL，置1.5mL塑料离心管中，补加50μL甲醇，加20ng·mL^-1内标溶液20μL，加入40μL 1％甲酸，加入400μL甲醇，涡混1min，超声10min，4℃、12000rpm离心10min，取上清液置离心管中，37℃N₂吹干，残留物用200μL50％甲醇水溶液溶解，涡混1min，超声10min，4℃、12000r/min离心10min，取上清液供HPLC-ESI-MS/MS检测分析。