[发明专利]一种人脐带间充质干细胞无血清培养基

说明书

本发明提供了一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于包括α‑MEM基础培养基，还包括如下组分：以终浓度计，谷氨酰胺1‑20mM、HEPEs 1‑20mM、腐胺10‑100μM、转铁蛋白0.1‑10μM、维生素C 10‑400μM、重组胰岛素1‑10μM、黄体酮1‑20nM、皮质醇10‑200nM、人血白蛋白1‑20mg/mL、碱性成纤维细胞生长因子1‑10ng/mL、转化生长因子β11‑10ng/mL、螺旋藻速溶蛋白多糖1‑50mg/mL。本发明提供的人脐带间充质干细胞无血清培养基可显著提高人脐带间充质干细胞的增殖速率和贴壁性能，有利于人脐带间充质干细胞的增殖和干细胞特性的保持，具有成脂、成骨诱导分化潜能。培养基成分简单、明确、稳定，不含任何血清组分，克服了异种蛋白污染和致病微生物的危险，安全性高。

技术领域

本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种人脐带间充质干细胞无血清培养基的配方及其应用。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是来源于早期中胚层的成体干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，是造血微环境中的一种重要的细胞成分，可以向多种组织如骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪及基质细胞增殖分化，而且免疫原性弱，是组织工程立项的种子细胞来源。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymalstem cells，hUC-MSCs)来源于新生儿脐带中的华通氏胶，除具有MSCs的所有特性外，还具有含量丰富，细胞纯净，免疫原性更低，细胞原始、分化能力更强，无伦理限制等优势，可为实验和临床提供充足的细胞来源，具有广阔的临床应用前景。

现有的用于培养hUC-MSCs的培养基主要分为三类。一类是基础培养基中添加动物血清，弊端是无法规避动物血清中的异源体，可能存在人体异种蛋白污染或过敏，风险较大；第二类是基础培养基中添加人血小板裂解液之类的血清替代物，但是同样有成分不明的蛋白存在，批次差异较大，来源不稳定等缺点。第三类是基础培养基中添加化学组分明确的血清替代成分，这既满足了hUC-MSCs的培养要求，又有效避免了前两类培养基的诸多不利因素。因此，适合hUC-MSCs细胞生长的化学配方确定的细胞培养基是干细胞走向临床的重要条件。

然而，目前市面上正在销售的商品化MSCs无血清培养基，无论是国外进口还是国内研发生产，不仅价格昂贵，细胞培养的效果也不理想。与血清培养体系相比细胞状态差、细胞贴壁性差、操作繁琐、细胞增殖速率不够，而且细胞老化速度快，MSCs的分化能力降低。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，发明人通过反复的实验验证，获得了一种新的人脐带间充质干细胞无血清培养基，可以有效的对脐带间充质干细胞进行培养。

本发明所提供的人脐带间充质干细胞无血清培养基，是使用α-MEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：谷氨酰胺1-20mM、HEPEs 1-20mM、腐胺10-100μM、转铁蛋白0.1-10μM、维生素C 10-400μM、胰岛素1-10μM、黄体酮1-20nM、皮质醇10-200nM、人血白蛋白1-20mg/mL、碱性成纤维细胞生长因子1-10ng/mL、转化生长因子1-10ng/mL、速溶蛋白多糖1-50mg/mL。

所述的速溶蛋白多糖是从螺旋藻中提取的一种水溶性多糖，是一种无毒的天然生物活性物质，具有促进细胞生长、提高免疫力、抗肿瘤、抗辐射、抗氧化、抗衰老、对核酸内切酶活性和DNA修复合成有增强作用等功能。

所述的速溶蛋白多糖，其制备方法如下：将螺旋藻干粉清洗，加水后在75-90℃下加热，然后冷却至常温，减压过滤分离，用盐酸调节滤液pH值至3-5，放置12-36h，4000rpm，离心15min离心；分离得到的上清液用Na₂CO₃溶液调节pH至7.0，然后喷雾干燥，得到藻蛋白多糖提取物。