[发明专利]VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统在植物基因编辑中的应用

说明书

本发明公开了VQRn‑Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统在植物基因编辑中的应用。本发明公开的VQRn‑Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统由VQRn‑Cas9、PmCDA1、UGI和如式I所示的sgRNA组成；靶点序列转录的RNA‑sgRNA骨架(式I)，sgRNA骨架为将序列1的第571‑646位或序列7中的T替换为U得到的RNA。本发明的VQRn‑Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统，在植物中实现了靶点序列的编辑，尤其是靶点序列中由C到T的替换，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统在植物基因编辑中的应用。

背景技术

CRISPR-Cas9技术已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。CRISPR/Cas9protein-RNA复合物通过向导RNA(guide RNA)定位于靶点上，切割产生DNA双链断裂(dsDNA break，DSB)，而后生物体会本能的启动DNA修复机制修复DSB。修复机制一般有两种，一种是非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)，另一种是同源重组(homology-directed repair，HDR)。通常情况下NHEJ占大多数，因此修复产生的随机的indels(insertions or deletions)比精确修复高很多。对于碱基精确替换，因为HDR效率低以及需要DNA模板，所以使用HDR实现碱基精确替换的应用受到很大的限制。

2016年，David Liu和Akihiko Kondo两个实验室分别独立报道了两种不同类型的胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor，CBE)，分别使用了两种不同的胞苷脱氨酶rAPOBEC1(rat APOBEC1)和PmCDA1(activation-induced cytidine deaminase(AID)ortholog from sea lamprey)，原理都是通过使用胞苷脱氨酶直接实现对单个胞嘧啶(Cytosine，C)碱基进行编辑，而不再通过产生DSB和启动HDR修复，大大提高了C替换为胸腺嘧啶(Thymine，T)的碱基编辑效率。具体为dead Cas9(dCas9)或the Cas9nickase(Cas9n)连带着rAPOBEC1或PmCDA1通过sgRNA定位到靶点，rAPOBEC1或PmCDA1催化非配对的单链DNA上的C发生胞嘧啶脱氨反应变成尿嘧啶(Uracil，U)，通过DNA的修复使得U与腺嘌呤(Adenine，A)配对，又通过DNA复制，最终使得T与A配对，从而实现了C到T的转换。在所测试的编辑器中，SpCas9n(D10A)&rAPOBEC1/PmCDA1&UGI碱基编辑系统(其含有尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂(uracil DNA glycosylase inhibitor，UGI))的平均突变率较高，原因有二：一是UGI可以抑制尿嘧啶DNA糖化酶(uracil DNA glycosylase，UDG)催化清除DNA中U，二是SpCas9n(D10A)在非编辑链上产生切口，诱导真核错配修复机制或long-patch BER(base-excision repair)修复机制，促使U:G错配更多的偏好性修复成U:A。

目前，SpCas9n(D10A)&rAPOBEC1/PmCDA1&UGI碱基编辑系统已被广泛应用到水稻中，实现C到T的转换，但编辑的靶点主要局限在PAM(Protospacer Adjacent Motif)为NGG的序列，大大限制了可编辑的C的范围。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何将生物体或生物细胞中PAM序列为NGA的靶点序列中的C突变为T。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种成套试剂(为VQRn-Cas9&PmCDA1&UGI碱基编辑系统)，所述成套试剂由M1、M2、M3和M4组成：