[发明专利]一种快速单反应管提取长片段基因组DNA的方法和试剂盒

说明书

本发明涉及一种快速单反应管提取长片段基因组DNA的方法，包括以下步骤：a)向样品中加入裂解液和蛋白酶K，使细胞裂解并释放基因组DNA；b)向步骤a)的反应体系中加入沉淀剂，获得基因组DNA的沉淀；c)用清洗液洗涤所得的基因组DNA的沉淀；d)用溶解液溶解基因组DNA。本发明还涉及适用于上述方法的试剂盒。

技术领域

本发明涉及提取基因组DNA的领域。具体地，本发明涉及一种快速单反应管提取长片段基因组DNA的方法，以及适用于此方法的试剂盒。

背景技术

长片段基因组DNA分子的制备在生物学领域，特别是DNA测序和基因组组装中有着广泛的需求。Pacific Biosicences的SMRT长读长测序技术对于单分子测序长度可达60-100Kb¹，而Oxford Nanopore Technology的纳米孔测序技术则可检测长达Mb级别的单分子DNA片段²。用于单体型拼接和基因组组装的10x Genomics³和CPT-seq⁴等linked-reads技术则需要制备长度为几十到几百Kb的基因组分子片段。BioNano Genomics公司的基于Saphyr平台的单分子光学图谱技术可以辅助基因组组装、检测染色体结构变异和基因遗传病的检测，用于其标记的分子长度N50(≥150Kb)约为300Kb，最长单分子可达Mb级别⁵。测序技术和光学图谱等技术的发展，对简单快速地提取长片段基因组DNA分子有了更高的需求。

目前主流的提取基因组DNA的方法有经典的酚氯仿抽提-乙醇/异丙醇沉淀法、硅胶膜柱或吸附磁珠纯化法。由于机械力和剪切力的作用，普通的硅胶膜柱或吸附磁珠纯化法得到的基因组DNA长度都低于50Kb。而经典的酚氯仿抽提-乙醇/异丙醇沉淀法需要使用剧毒的有机溶剂酚氯仿，而且由于细胞裂解后非常粘稠，在液相酚氯仿抽提时操作比较困难⁶。Phase-lock凝胶的使用可以解决酚氯仿抽提分离的问题，但是整个操作过程仍然非常繁琐²。近年来，报道了一些新型的基于硅片或核酸探针的提取长片段基因组DNA的方法，但是受到材料或操作的限制，均未得到推广使用^7，8。此外，以上方法虽然可以提取长达几百Kb的基因组DNA片段，但是仍然无法达到Mb级别。

目前最经典的用于提取高纯度长片段基因组DNA的方法是基于低熔点琼脂糖凝胶包埋的固相基因组DNA提取法。该方法可提取长达Mb级别的高纯度基因组DNA，但是包括将细胞包埋成琼脂糖胶块、蛋白酶K消化处理、胶块溶解、胶块酶解和基因组DNA透析等步骤，操作过程非常繁琐，耗时超过24小时，不利于大规模应用。并且，上述提取基因组的方法都涉及到基因组DNA在不同的反应管中转移，不仅操作繁琐，而且会导致基因组DNA的损失，甚至造成基因组DNA的污染。

鉴于此，本发明提供了一种新的提取长片段基因组DNA的方法，该方法仅包含裂解细胞或组织、沉淀基因组DNA、清洗基因组DNA和溶解基因组DNA四个步骤。该方法可快速地提取长达Mb级别的基因组DNA，大大缩短基因组DNA提取时间，使得提取过程更为快速和简单。并且，本发明的方法可以在单个反应管中进行而不需要转管，节约时间的同时也避免了基因组DNA的污染和损失。最后所沉淀的长片段基因组DNA容易溶解，均一性高，满足各种长片段测序及光学图谱等技术对长片段基因组DNA的要求。

发明内容

本发明的目的在于解决现有长片段基因组DNA提取时，耗时长、操作复杂的问题。通过在单反应管中直接裂解细胞、释放基因组DNA、沉淀基因组DNA、清洗基因组DNA和溶解基因组DNA，本发明实现了快速制备长片段基因组DNA的目标。

因此，第一个方面，本发明提供一种提取长片段基因组DNA的方法，包括以下步骤：

a)向样品中加入裂解液和蛋白酶K，使细胞裂解并释放基因组DNA；

b)向步骤a)的反应体系中加入沉淀剂，获得基因组DNA的沉淀；