[发明专利]基于高效液相色谱串联高分辨质谱的弓形虫的脂质组学分析方法及应用

说明书

本发明公开了一种基于高效液相色谱串联高分辨质谱的弓形虫的脂质组学分析方法及应用，该脂质组学分析方法包括：将待测虫体样品用氯仿‑甲醇‑水溶液悬起后超声波破碎，提取液经离心、氮吹和甲醇复溶后过滤进样，使用液相C18色谱柱分离，利用由乙腈、异丙醇、乙酸铵、甲醇和水组成的A和B流动相进行洗脱，之后分别在正、负离子模式下用QTOF高分辨质谱仪全扫描模式检测，根据目标脂类分子的化学式，对测得的数据进行筛查和鉴定；该方法具有灵敏、准确和不依赖标准化合物的优点，可高效地适用于弓形虫脂质组学分析。

技术领域

本发明是关于分子寄生虫学和分析化学，特别是关于一种基于高效液相色谱串联高分辨质谱的弓形虫的脂质组学分析方法及应用。

背景技术

龚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是顶复亚门的胞内寄生原虫，宿主范围广泛，能够寄生于几乎所有温血动物和人的有核细胞，在细胞内形成纳虫空泡，以内二分裂方式进行增殖，引发急性期感染，随着宿主免疫系统的作用，急性感染转变为慢性感染，弓形虫速殖子转化为缓殖子，以包囊形式长期存在于组织器官，尤其见于脑、神经及肌肉组织中，使宿主携带弓形虫。弓形虫致病机制复杂，宿主种类、性别、年龄及其免疫状态等诸多因素和虫株的致病力均可影响宿主感染弓形虫后的临床表现，弓形虫病已在世界范围内广泛流行，严重威胁人和动物的健康。脂类代谢对弓形虫的生长、发育和繁殖具有重要作用。弓形虫的脂类摄取、合成和利用过程及机制复杂，其所需脂类既可从宿主细胞摄取，也可自身合成。顶质体是弓形虫从头合成脂肪酸的场所，内质网是脂肪酸延长和去饱和的主要细胞器。这些脂肪酸在内质网和线粒体合成复杂多样的脂类衍生物，例如甘油酯、磷脂和鞘磷脂等。脂质分子结构的多样性、复杂性以及相应分析手段的滞后阻碍了对弓形虫整体脂类和其复杂的代谢网络和功能调控进行系统研究。因此，建立一种高效快速的脂质组学分析平台对于揭示弓形虫脂类分子种类和功能至关重要。

目前对于弓形虫脂类分子的检测主要集中于脂肪酸和磷脂。经典的脂肪酸检测方法主要基于气相色谱质谱联用技术，但该技术存在无串极能力、分辨率低、样品衍生化过程复杂、检测速度慢等多种缺点。磷脂的检测主要依赖于液相色谱串联三重四极杆质谱，同样存在分辨力不足，容易受m/z近似的离子干扰的问题。近年来，高通量和高精度的高分辨质谱技术的发展(例如四极杆飞行时间质谱)使得科研人员能够对生物样品中的脂质分子进行更加快速、全面和精确的分析鉴定。

鉴于此，本发明应用基于高效液相色谱串联高分辨质谱建立了一种快速确定脂质组学中脂质分子组成的方法，对研究顶复亚门原虫的脂类代谢具有重要意义。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于高效液相色谱串联高分辨质谱的弓形虫的脂质组学分析方法及应用，该弓形虫的脂质组学分析方法不需要标准品化合物，可快速完成对弓形虫速殖子精确的脂质组学分析。

为实现上述目的，本发明提供了一种基于高效液相色谱串联高分辨质谱的弓形虫的脂质组学分析方法，包括以下步骤：步骤1，将收集的弓形虫速殖子用氯仿-甲醇-水的提取液悬起，进行超声波破碎，得到第一悬浮液；步骤2，将所述第一悬浮液离心后收集有机相，并用氮气吹干所述有机相，使所述有机相得以浓缩，进而用甲醇溶液复溶浓缩后的有机相，利用聚四氟乙烯滤膜将氮吹后复溶的样品进行过滤，得待测样品；步骤3，将所述待测样品通过色谱柱中的流动相洗脱进行分离后，然后分别在正、负离子模式下使用四极杆飞行时间高分辨质谱仪进行测定，根据目标脂类分子的化学式和相对分子量，将检测数据与之比对，获得目标脂类分子的提取离子流图和质谱图，从而鉴定得到弓形虫的多种脂类分子。