[发明专利]一种提高外源基因在真核细胞中进化效率的方法

权利要求书

1.一种提高外源基因在真核细胞中进化效率的简便方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(I)以穿梭重组质粒为模板构建两对引物，引物对P₁/P₂和引物对P₃/P₄；

(II)以P₁/P₂为一对引物，扩增出上游片段P₁P₂；以P₃/P₄为另一对引物，扩增出下游片段P₃P₄；

(III)利用重叠延伸PCR方法，在P₁/P₄为一对引物的作用下，扩增出整个重组基因片段P₁P₄；

(IV)将扩增产物利用脉冲电击转入毕赤酵母感受态细胞，加入预冷1M山梨醇，置于37℃孵育1h，之后的转化液涂布于含有抗性的YPD平板上，等待单克隆的长出；

其中，引物对P₁/P₄分别来自于穿梭质粒上与毕赤酵母染色体发生同源重组的基因片段部分，其中引物P₁来自穿梭质粒上同源重组的上游基因部分，引物P₄来自穿梭质粒上同源重组的下游部分；引物P₂和引物P₃包含目的基因定点饱和突变的位点，用NNK/NNM来代表突变的核苷酸，两个饱和突变引物之间至少有15个碱基重叠。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的穿梭质粒选自pPIC系列、pPICZα系列或者pGAPZα系列。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电击转化时需用到线性质粒，浓度可以控制在10～500ng。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的毕赤酵母感受态细胞选自GS115、X33、KM71或SMD1168细胞。