[发明专利]一种基于水溶性试剂的快速组织透明化的处理方法及其应用

说明书

本发明提供了一种基于水溶性试剂的快速组织透明化的处理方法及其应用，所述处理方法包括如下步骤：将经多聚甲醛固定过的组织放入组织膨胀处理剂中充分浸泡使其疏松膨胀，去除脂质；将组织膨胀处理剂充分浸泡过的组织放入组织收缩剂中，使其由膨胀状态收缩回原始状态，并获得初步的透明效果；将在组织收缩剂中充分处理的组织放入折射率匹配试剂进行浸泡，最终得到折射率相对均一的高度透明化的组织。经本发明处理后的组织变得高度透明，可以用于组织整体三维荧光成像中，实现对全脑神经网和器官血管网结构进行三维高分辨成像。

技术领域

本发明属于生物医学光学成像技术领域，尤其涉及一种基于水溶性试剂的快速组织透明化的处理方法及其应用。

背景技术

生物组织的整体高分辨成像可以为生命科学的研究提供完整、精细的三维组织结构信息，从而更好地理解组织网络结构与功能的关系。基于传统组织切片技术获取三维结构，费时费力，且易导致结构信息的丢失，图像重建难度大。近年来，多种荧光标记技术及显微成像技术的结合为获取组织的三维结构信息提供了全新思路。然而，生物组织的高散射特性使得光学成像技术在生物组织中的成像深度有限，无法满足大块组织的成像需求，如激光共聚焦显微镜的深度约为50-100μm,双光子显微镜的成像深度也仅有500-800μm,组织光透明技术的出现为大组织三维结构的整体成像提供了重要方法。组织光透明技术即通过向组织中引入高渗、高折射率的化学试剂，提高组织中各成分间折射率匹配程度，降低组织的散射，使组织变得“透明”,从而提升光学显微镜的成像深度。近年来，组织光透明的发展吸引了众多神经科学家的关注与参与，不断有新的光透明方法被提出。其中基于水溶性试剂的方法以其对荧光信号的较好保持和对样本形变的有效控制，受到生命学家的青睐。然而，基于水溶性试剂的方法透明速度缓慢，往往需要数周甚至数月的时间来实施组织透明，并且透明效果有限。这种缺点极大的限制了目前光透明方法在生命科学研究中的应用。

发明内容

针对现有技术中的上述缺陷，本发明的主要目的在于提供一种基于水溶性试剂的快速组织透明化的方法及其应用，经处理后的多种组织可在短时间内变得高度透明，可以用于组织整体荧光显微成像中，实现对全脑神经网和器官血管网结构的三维高分辨荧光成像。

为了达到上述目的，本发明第一方面提供了一种基于水溶性试剂的快速组织透明化方法，所述处理方法包括如下步骤：

S1、将经多聚甲醛固定过的组织放入组织膨胀处理剂中充分浸泡使其疏松膨胀，去除脂质；

S2、将步骤S1所得组织放入组织收缩剂中处理，使其由膨胀状态收缩回原始状态，并获得初步的透明效果；

S3、将步骤S2所得组织放入折射率匹配剂中浸泡，得到折射率相对均一的高度透明化的组织。

优选的，步骤S1中，所述组织膨胀处理剂的组份包括间苯二甲胺和山梨醇，其余为水。间苯二甲胺携带的双NH₃基团会与组织发生水合作用，解离组织中致密的纤维，溶解脂质，使组织迅速吸水膨胀，从而降低组织各成分折射率的差异，加快处理速度。山梨醇则为良好的组织结构保持剂，避免组织结构和一些蛋白遭到破坏。

作为进一步的优选，步骤S1中，所述组织膨胀处理剂中间苯二甲胺、山梨醇的质量浓度分别为5％-20％、5％-15％。

优选的，步骤S2中，所述组织收缩剂的组份包括间苯二甲胺、山梨醇和磷酸盐缓冲液。

作为进一步的优选，步骤S2中，所述组织收缩剂中间苯二甲胺、山梨醇的质量浓度分别为20％-40％、15％-30％，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M- 0.05M。提升间苯二甲胺、山梨醇的浓度可以对经膨胀后的组织实施快速透明化，并控制膨胀的组织进行回缩，同时磷酸盐缓冲液的引入进一步增加溶液的渗透压，使组织向最初形态收缩。

优选的，步骤S3中，所述折射率匹配剂的组份包括间苯二甲胺和山梨醇，其余为水。