[发明专利]一种提高异戊二烯产量的基因工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种提高异戊二烯产量的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌过表达含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸激酶基因ERG12，含有D18包裹信号肽序列的磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19、含有D18包裹信号肽序列的异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1、含有D18包裹信号肽序列的异戊二烯合成酶的基因IspS_pa、以及含有PduA、PduB、PduJ、PduK、PduN和PduU基因簇的重组质粒，出发菌株为大肠杆菌；所述甲羟戊酸激酶基因ERG12，为来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的甲羟戊酸激酶基因ERG12，GeneBank登录号为855248；所述磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，为源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，GeneBank登录号为855260；所述甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19，为源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19，GeneBank登录号为100195467；所述异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1，为源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1，GeneBank登录号为855986；所述异戊二烯合成酶基因IspS_pa，为源于银白杨（Populus alba）的异戊二烯合成酶基因IspS_pa， GeneBank登录号为AB198180；所述D18包裹信号肽的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示；所述含有PduA、PduB、PduJ、PduK、PduN和PduU基因簇的重组质粒为pLysS-PduABJKNU。

2.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）第一重组质粒构建：分别将D18包裹信号肽序列添加到甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19以及异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1上游，获得含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸激酶基因ERG12、含有D18包裹信号肽序列的磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和含有D18包裹信号肽序列的异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1，然后将上述各基因连接到质粒pETduet-1上，获得第一重组质粒pETduet-D18-IDI1-D18-ERG19-D18-ERG8-D18-ERG12；

2）第二重组质粒构建：将含有D18包裹信号肽序列连接到质粒pYJM21中异戊二烯合成酶的基因IspS_pa基因的上游，获得第二重组质粒pYJM21-D18；

3）将步骤1）所得的第一重组质粒，步骤2）所得的第二重组质粒以及含有PduA、PduB、PduJ、PduK、PduN和PduU基因簇的重组质粒pLysS-PduABJKNU导入到大肠杆菌感受态细胞中，获得基因工程菌。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤1）所述甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1通过化学合成、扩增自微生物或扩增自重组质粒获得。

4.权利要求1所述的基因工程菌在发酵生产异戊二烯中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，利用该基因工程菌，通过体外酶催化反应生产异戊二烯：该基因工程菌经诱导表达制备蛋白小体，再将蛋白小体加入到体外酶催化反应体系中，孵育制备获得异戊二烯；所述体外酶催化反应体系，每2mL体系中含有如下组分：10 mM pH值7.4的PBS缓冲液、4 mM ATP、30 mM KCl、8 mM MgCl₂、0.2 mM MnCl₂、0.01 mMZnSO₄、4mM β-巯基乙醇和1 ml的0.25mM的甲羟戊酸，0.2g/L蛋白小体100uL。