[发明专利]一种检测蛋白质和RNA相互作用的方法

说明书

本发明公开了一种检测蛋白质和RNA相互作用的方法，包括如下步骤：(1)提供亲和素标记的RNA，进行生物素标记；(2)取步骤(1)所得RNA，加入结构缓冲液，使得RNA形成二级结构，然后加热、冰浴、室温静置；(3)提供纯化的蛋白；(4)将步骤(2)所得RNA和步骤(3)纯化的蛋白混合，利用BLI生物干涉膜方法，对步骤(2)所得RNA和步骤(3)纯化的蛋白进行动力学检测，即得。本发明首次利用BLI生物干涉膜技术检测蛋白质与lncRNA相互作用，与现有方法比较，本发明可同时检测3个以上蛋白与lncRNAs相互作用，可在30分钟内完成检测，具有检测快速，可精确定量相互作用力的强弱，能实现高通量检测等优点。

技术领域

本发明涉及生物大分子技术领域，尤其是一种检测蛋白质和RNA相互作用的方法。

背景技术

RNA Pull-down是现在检测RNA与蛋白质相互作用最常用的方法之一；RNA Pull-down是定性的检测，无法定量检测RNA与蛋白质结合强弱。BLI生物膜干涉技术常用与检测蛋白与蛋白的相互作用，蛋白与小分子的相互作用。现有技术中并没有能准确检测蛋白质和RNA相互作用力强弱的方法。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能准确检测蛋白质和RNA相互作用力的强弱的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种检测蛋白质和RNA相互作用的方法，包括如下步骤：(1)提供亲和素标记的RNA，进行生物素标记；(2)取步骤(1)所得RNA，加入结构缓冲液，使得RNA形成二级结构，然后加热、冰浴、室温静置；(3)提供纯化的蛋白；(4)将步骤(2)所得RNA和步骤(3)纯化的蛋白混合，利用BLI生物干涉膜方法，对步骤(2)所得RNA和步骤(3)纯化的蛋白进行动力学检测，即得。

优选地，所述RNA为lncRNA(长链非编码RNA)。

优选地，所述步骤(2)中结构缓冲液中含有：10mM Tris，0.1M KCl和10mM MgCl₂；且结构缓冲液的pH值为7.0。

优选地，所述步骤(4)中BLI生物干涉膜方法包括以下5个步骤：

(4.1)基线均一化(Baseline)，时间为1min；

(4.2)固化，通过SR固化传感器捕捉生物素标记的lncRNA,lncRNA的浓度范围为100-200nM，固化时间为5-10min；

(4.3)基线均一化(Baseline)，时间为3min；

(4.4)结合(Association)，在样品板检测孔加入不同浓度梯度纯化蛋白，使之与固化的lncRNAs相互结合，结合(Association)时间为5-10min；

(4.5)解离(Dissociation)，时间为5-10min。

优选地，所述步骤(3)中蛋白纯化的步骤包括：

(3.1)将重组蛋白表达菌株按1:100比例稀释后，转接至1L的LB培养瓶中，37℃，220rpm培养2.5-3h，加入诱导剂诱导；

(3.2)将步骤(3.1)所得菌株转移至25-28℃摇床，160rpm，培养12-16h；收集菌体，无菌生理盐水洗涤2次，加入50mM Tris-HCl，于超声破碎仪上超声破碎，破碎完后离心，之后分离上清液；

(3.3)步骤(3.2)所得上清液加入1-2mL经水洗过的镍亲和树脂，于4℃缓慢摇动1h，过柱；所得全部上清液添加镍树脂混合液过柱2次，后用20倍柱床体积超声破碎缓冲液平衡柱床，再用20mM咪唑溶液洗涤20倍的柱床体积，以除去杂蛋白；之后依次用50mM、100mM、200mM、500mM咪唑溶液洗涤10倍的柱床体积，各梯度洗脱液分别回收；