[发明专利]一种检测蛋白质和RNA相互作用的方法

权利要求书

1.一种检测蛋白质和RNA相互作用的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提供亲和素标记的RNA，进行生物素标记；

(2)取步骤(1)所得RNA，加入结构缓冲液，使得RNA形成二级结构，然后加热、冰浴、室温静置；

(3)提供纯化的蛋白；

(4)将步骤(2)所得RNA和步骤(3)纯化的蛋白混合，利用BLI生物干涉膜方法，对步骤(2)所得RNA和步骤(3)纯化的蛋白进行动力学检测，即得。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA为lncRNA。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中结构缓冲液中含有：10mMTris，0.1M KCl和10mM MgCl₂；且结构缓冲液的pH值为7.0。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中BLI生物干涉膜方法包括以下5个步骤：

(4.1)基线均一化，时间为1min；

(4.2)固化，通过SR固化传感器捕捉生物素标记的lncRNA,lncRNA的浓度范围为100-200nM，固化时间为5-10min；

(4.3)基线均一化，时间为3min；

(4.4)结合，在样品板检测孔加入不同浓度梯度纯化蛋白，使之与固化的lncRNAs相互结合，结合时间为5-10min；

(4.5)解离，时间为5-10min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中蛋白纯化的步骤包括：

(3.1)将重组蛋白表达菌株按1:100比例稀释后，转接至1L的LB培养瓶中，37℃，220rpm培养2.5-3h，加入诱导剂诱导；

(3.2)将步骤(3.1)所得菌株转移至25-28℃摇床，160rpm，培养12-16h；收集菌体，无菌生理盐水洗涤2次，加入50mM Tris-HCl，于超声破碎仪上超声破碎，破碎完后离心，之后分离上清液；

(3.3)步骤(3.2)所得上清液加入1-2mL经水洗过的镍亲和树脂，于4℃缓慢摇动1h，过柱；所得全部上清液添加镍树脂混合液过柱2次，后用20倍柱床体积超声破碎缓冲液平衡柱床，再用20mM咪唑溶液洗涤20倍的柱床体积，以除去杂蛋白；之后依次用50mM、100mM、200mM、500mM咪唑溶液洗涤10倍的柱床体积，各梯度洗脱液分别回收；

(3.4)分别取10ul步骤(3.3)所得各梯度洗脱液，然后各加入10ul SDS上样缓冲液，煮沸10min后，进行SDS-PAGE电泳检测，根据电泳结果，选择相对较纯的梯度洗脱液，分装冻存即得。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3.1)中，诱导剂为IPTG，IPTG的加入量为：每300ml培养液加入50ul 0.5M的IPTG。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3.2)中，超声破碎的时间为50min，超声破碎仪的参数设置为：功率设置为30％；每超声4s，停3s。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3.2)中，超声破碎后离心条件为：14000rpm，离心35min；或9000rpm，离心90min。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3.3)中，咪唑溶液的pH值为7.4-8.0，其中还含有50mM Tris-HCl。