[发明专利]一种半纤维素糖化能力增强的米曲霉工程菌合成木糖醇的方法

说明书

本发明公开了一种半纤维素糖化能力增强的米曲霉工程菌合成木糖醇的方法，包括如下步骤：1)获得米曲霉菌株；2)利用基因同源重组技术缺失作为筛选标记的乳清酸核苷‑5’‑磷酸脱羧酶基因(pyrG)，构建基于pyrG缺失的尿苷营养缺陷型同源转化体系，为后续基因改造提供尿苷营养缺陷型宿主菌；3)利用筛选标记可循环利用的基因缺失技术无痕缺失xdh基因，获得半纤维素糖化能力增强的木糖醇CBP工程菌。

技术领域

本发明涉及一种半纤维素糖化能力增强的米曲霉工程菌合成木糖醇的方法。

背景技术

木糖醇即木戊醇，在自然界中普遍存在，如瓜果、蔬菜及谷物中，但是含量极低。木糖醇的生产方法主要有提取法、化学合成法和生物转化法。其中，提取法因得率很低且生产成本高，不能满足市场需要。工业生产中，主要以传统的化学加氢法生产木糖醇，虽然技术成熟，但是工艺复杂、能耗高以及安全性能差，不利于木糖醇的推广生产。生物转化法是一种时新高效的木糖醇生产方式，主要是将林牧业废弃物中所含的木质纤维素经简单处理后得到木糖水解液，然后利用微生物发酵中的获得醇。因其具有反应条件温和，环境友好设备投资少等优点是一种十分具有应用前景的木糖醇生产方法。

木质纤维素的生物转化主要包括四个过程：原料预处理、水解酶的生产及酶解、己糖发酵和戊糖的发酵。以上4个过程可以分步进行，也可以进行局部或全过程的整合。

但现有技术中，纤维素与半纤维素的降解都需要添加外源纤维素水解酶及半纤维素水解酶。利用商业化的木质纤维素酶制剂进行水解木质纤维素时，酶的需求量大，酶解效率不佳，且纤维素酶制剂产率低，制备成本昂贵，很大程度上限制了木质纤维素发酵产业的发展

一体化生物加工(Consolidated bioprocessing，CBP)是指在不添加任何外源水解酶的情况下，直接将木质纤维素原料一步转化为生物化学品的生物加工过程。理想的CBP工程菌需要同时具有将木质纤维素水解为单糖和发酵单糖为目标代谢物的能力。

米曲霉是传统的食品安全生产菌，能胞外分泌半纤维素降解酶系，且胞内含有木糖分解代谢相关酶系。发明人前期利用代谢工程手段获得了木糖醇脱氢酶基因(xdh)缺失的米曲霉突变株C3-1，其能够将50g/L木聚糖直接转化为8.12g/L木糖醇，实现了米曲霉CBP法生产木糖醇。但突变株C3-1半纤维素糖化能力仍偏低，因此增强米曲霉半纤维素糖化能力是进一步提高CBP法合成木糖醇产量的关键。

发明人前期已经通过诱变筛选获得一株木聚糖酶酶活力相比C3-1提高一倍的米曲霉突变株A73(发表于华侨大学学报，自然科学版，第32卷第6期，“米曲霉木聚糖酶高产菌株选育”，2011年11月，李晨，陈宏文)。

发明内容

本发明的主要目的，在于提供一种半纤维素糖化能力增强的米曲霉工程菌合成木糖醇的方法，其包括如下步骤：

1)获得米曲霉菌株；

2)用带有乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)基因敲除盒的打靶载体pMD-pyrGAB转化步骤1)的米曲霉菌株，通过抗性表型筛选和PCR验证，得到pyrG缺失的尿苷缺陷型突变株；以pyrG缺失的尿苷缺陷型突变株为受体菌，用携带pyrG筛选标记的重组载体pMD-pyrG进行互补转化，获得pyrG⁺回复突变株，构建基于pyrG缺失的尿苷营养缺陷型同源转化体系；

3)利用筛选标记可循环利用的基因缺失技术(Latour system)无痕缺失xdh基因，获得米半纤维素糖化能力增强的木糖醇CBP工程菌。

4)利用步骤3)得到的米曲霉工程菌合成木糖醇。

优选地，步骤1)获得的米曲霉菌株为米曲霉A73。