[发明专利]一种半纤维素糖化能力增强的米曲霉工程菌合成木糖醇的方法

权利要求书

1.一种半纤维素糖化能力增强的米曲霉工程菌合成木糖醇的方法，包括如下步骤：

1）获取米曲霉菌株，所述的米曲霉菌株为米曲霉A. oryzae A73；

2）用带有pyrG基因敲除盒的打靶载体pMD-pyrGAB转化A. oryzae A73，通过5-氟乳清酸5-FOA抗性表型筛选和PCR验证，得到pyrG缺失的尿苷缺陷型突变株A. oryzae C16；以C16为受体菌，用携带pyrG筛选标记的重组载体pMD-pyrG进行互补转化，获得pyrG⁺回复突变株，建立以pyrG为筛选标记的同源转化体系；

3）利用筛选标记可循环利用的基因缺失技术无痕缺失xdh基因，获得半纤维素糖化能力增强的米曲霉工程菌：打靶载体pMD-pyrG-xdhABC的构建方法为：采用引物扩增米曲霉xdh上游片段xdh-A、xdh-B、下游片段xdh-C及pyrG四条片段；pyrG片段与pMD19-T连接，得到重组质粒pYRG；用限制性内切酶 SphI/HindIII双酶切，与xdh-B片段连接，获得重组质粒pYRG-B；用SacI/SmaI双酶切，与xdh-A片段连接，获得重组质粒 pYRG-AB；该质粒用BamH I单酶切，再分别用T4 DNA 聚合酶和碱性磷酸酶平滑化、去磷酸化处理，与经T4多聚核苷酸激酶处理、5’端磷酸化的xdh-C片段进行平端连接，得到打靶载体；以C16为宿主菌，利用筛选标记可循环利用的基因缺失技术将携带pyrG的xdh无痕缺失打靶载体pMD-pyrG-xdhABC转化受体细胞，经过两次同源整合后，经5-FOA抗性筛选和PCR验证，最终获得pyrG、xdh双缺失的突变株；扩增米曲霉xdh上游片段xdh-A、xdh-B、下游片段xdh-C及pyrG四条片段的引物为：

xdh-A1：GCCGAGCTCCGGCGGAAATCAATAC

xdh-A2：TCCCCCGGGAAATCGCTTCGGTGAG

xdh-B1：CATGCATGCCAGAGTAGAATCCGAGTG

xdh-B2：CCCAAGCTTAACCTGACATCCACG

xdh-C1：TTGGTTTCTGCGGTGGCTTGTA

xdh-C2：ATTCGGCTCGGGTGGCGGTTC

pyrG-F：AAAATGCGAAGGTAAGTG

pyrG-R：AGTATGGAAAGAAAGAGGC

4)利用步骤3）得到的米曲霉工程菌合成木糖醇。

2.根据权利要求1所述的一种半纤维素糖化能力增强的米曲霉工程菌合成木糖醇的方法，其特征在于：打靶载体pMD-pyrGAB的构建方法为：以A. oryzae CICC2012的基因组为模板，分别用引物扩增pyrG 上下游同源重组片段1.0 kb PA和1.5 kb PB，用引物通过重叠延伸PCR将上下游片段拼接，2.5 kb拼接片段与2.7 kb线性载体pMD19-T连接，得到5.2 kb的pyrG敲除打靶载体pMD19-pyrGAB，并进行酶切验证。

3.根据权利要求2所述的一种半纤维素糖化能力增强的米曲霉工程菌合成木糖醇的方法，其特征在于：所述扩增pyrG 上下游同源重组片段的引物为：

PA-F：TAAGCCACGATCTCGATCATTAACTAAAGACCACGAGAGG

PA-R：aggtgtcttattcgtacggaTTGATATATGGAATGAAATG

PB-F：catttcattccatatatcaaTCCGTACGAATAAGACACCT

PB-R：CTGTGACCTGTCTCAAATTATAGAACGAAAACTCAAAGCC。