[发明专利]一种基于小麦种胚注射农杆菌的小麦遗传转化方法

说明书

本发明公开了一种基于小麦种胚注射农杆菌的小麦遗传转化方法，涉及遗传转化技术领域，所述小麦遗传转化方法包括以下步骤：1)受体准备；2)菌悬液制备；3)种胚注射农杆菌转化。为了解决传统的小麦遗传转化技术因需要离体组织培养与再生的过程而导致成本高、周期长且再生率低的问题，本发明通过在种胚内直接注入携带目标基因农杆菌的方法将目标基因导入小麦活体，结合目标基因PCR检测技术得到了可遗传的转基因后代，不需要基因枪等贵重仪器设备，成本低廉，一般实验室均可操作，且具有良好的再生率，无组织培养与再生过程，周期较短，且无小麦基因型依赖问题，同时取材方便，一年四季可以操作。

技术领域

本发明涉及遗传转化技术领域，具体是一种基于小麦种胚注射农杆菌的小麦遗传转化方法。

背景技术

小麦是世界上重要的粮食作物之一，是禾本科小麦属的重要栽培谷物。为了提高小麦的产量，通常需要采用小麦遗传转化技术将外源目的基因按照需要在体外采用人工重组导入小麦，进而补充和改进传统的杂交育种，大大缩短了育种周期。其中，小麦遗传转化技术，即将目标基因导入小麦体内，并稳定遗传和表达目标性状的技术，是小麦转基因育种，基因编辑育种，基因克隆与功能研究的基础。

目前，小麦遗传转化技术主要有基因枪转化和农杆菌介导的遗传转化法两大类，这两类转化方法都需要离体组织培养与再生的过程，导致这一过程的成本高、周期长且再生率低。因此，设计一种简便有效低成本的基于小麦种胚注射农杆菌的小麦遗传转化方法，成为目前亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于小麦种胚注射农杆菌的小麦遗传转化方法，以解决上述背景技术中提出的问题，通过直接以成熟种子胚为转化对象，通过在种胚内直接注入携带目标基因农杆菌来将目标基因导入小麦活体，结合目标基因PCR检测技术，得到了可遗传的转基因后代。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种基于小麦种胚注射农杆菌的小麦遗传转化方法，其特征在于，它包括以下步骤：

1)受体准备：选取受体的健康种子用蒸馏水进行冲洗3-5次，然后用质量浓度为1.5％的次氯酸钠进行浸泡消毒15min，再采用蒸馏水浸泡10min，然后用蒸馏水冲洗种子至无消毒液气味后置于铺两层滤纸的培养皿中，再加水至刚刚没过种子并在25℃下萌动发芽，得发芽种子A，备用；

2)菌悬液制备：将根癌农杆菌进行增殖培养得到菌液，然后倒入50ml的EP管中并在4℃下以4000rpm的速率进行离心10min，再除去上清液并加入10ml左右新鲜无抗生素的YEB培养液，调节OD值至0.9-1.2，然后加入乙酰丁香酮至终浓度为200μM，再在室温培养12小时进行活化，得农杆菌菌液B，备用；

3)种胚注射农杆菌转化：挑取步骤1)中的胚芽鞘长度达到0.5-1.0cm时(种子发芽时间为42-48小时)的发芽种子A，放至超净工作台风口处风干1小时，然后用1ml医用皮试针吸取0.5ml的步骤2)中得到的农杆菌菌液B对发芽种子A进行注射菌液，再将注射过菌液的发芽种子A进行风干30分钟，然后移载至盛有蛭石和草炭的营养钵中，浇透水后在室温下继续培育，即可。

作为本发明进一步的方案：步骤1)中，所述受体为普通小麦品种Bobwhite(国外转基因常用受体品种)和偃展4110(国内大面积种植品种)。

作为本发明再进一步的方案：步骤2)中，所述根癌农杆菌为将β-葡萄糖苷酸酶(GUS)编码基因连接在质粒载体pWMB110上得到的含有pWMB110质粒的根癌农杆菌。

作为本发明再进一步的方案：步骤2)中，所述增殖培养为吸取含有pWMB110质粒的根癌农杆菌加入至50ml的YEB液体培养基中，然后在28℃以200rpm的速率进行摇菌12小时，即可。