[发明专利]一种基于小麦种胚注射农杆菌的小麦遗传转化方法

权利要求书

1.一种基于小麦种胚注射农杆菌的小麦遗传转化方法，其特征在于，它包括以下步骤：

1)受体准备：选取受体的健康种子用蒸馏水进行冲洗，然后用质量浓度为1.5％的次氯酸钠进行浸泡消毒15min，再采用蒸馏水浸泡10min，然后用蒸馏水冲洗种子至无消毒液气味后置于铺两层滤纸的培养皿中，再加水没过种子并在25℃下萌动发芽，得发芽种子A，备用；

2)菌悬液制备：将根癌农杆菌进行增殖培养得到菌液，然后在4℃下以4000rpm的速率进行离心10min，再除去上清液并加入YEB培养液，然后加入乙酰丁香酮至终浓度为200μM，再在室温培养12小时进行活化，得农杆菌菌液B，备用；

3)种胚注射农杆菌转化：挑取步骤1)中的发芽种子A放至超净工作台风口处风干1小时，然后吸取0.5ml的步骤2)中得到的农杆菌菌液B对发芽种子A进行注射菌液，再将注射过菌液的发芽种子A进行风干30分钟，然后移载至盛有蛭石和草炭的营养钵中，浇透水后在室温下继续培育，即可。

2.根据权利要求1所述的基于小麦种胚注射农杆菌的小麦遗传转化方法，其特征在于，步骤1)中，所述受体为小麦品种Bobwhite和偃展4110。

3.根据权利要求1或2所述的基于小麦种胚注射农杆菌的小麦遗传转化方法，其特征在于，步骤2)中，所述根癌农杆菌为将β-葡萄糖苷酸酶编码基因连接在质粒载体pWMB110上得到的含有pWMB110质粒的根癌农杆菌。

4.根据权利要求3所述的基于小麦种胚注射农杆菌的小麦遗传转化方法，其特征在于，步骤2)中，所述增殖培养为吸取含有pWMB110质粒的根癌农杆菌加入至50ml的YEB液体培养基中，然后在28℃以200rpm的速率进行摇菌12小时，即可。

5.根据权利要求4所述的基于小麦种胚注射农杆菌的小麦遗传转化方法，其特征在于，所述YEB液体培养基包括50μl的浓度为50mg/ml的卡那霉素和50μl的浓度为50mg/ml的利福平。

6.根据权利要求5所述的基于小麦种胚注射农杆菌的小麦遗传转化方法，其特征在于，步骤3)中，所述注射菌液为将发芽种子A的胚芽鞘和种胚向上，一手用镊子固定发芽种子A，另一手沿发芽种子A的胚芽鞘向种胚内注射菌液，直至有菌液从胚芽鞘端部渗出。

7.根据权利要求6所述的基于小麦种胚注射农杆菌的小麦遗传转化方法，其特征在于，步骤3)中，所述蛭石和草炭的重量比为2:1。

8.一种如权利要求1-7任一所述的基于小麦种胚注射农杆菌的小麦遗传转化方法在小麦转基因育种中的应用。