[发明专利]一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚糖酶的方法

说明书

本发明提供了一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚糖酶的方法，所述的蛋白酶缺失微生物是枯草芽孢杆菌WB800，包括以下步骤：S1：将所述枯草芽孢杆菌WB800接种于活化培养基平板，置于培养箱内倒置培养以活化菌株；S2：挑取步骤S1活化后的单菌落接种于种子培养基，置于摇床震荡培养至种子液的OD₆₀₀达到0.6~1.0；S3：将步骤S2中的种子液接入发酵培养基中，置于摇床震荡培养；S4：将步骤S3发酵后的产物进行离心，收集上清液，获得壳聚糖酶的粗酶液。本发明采用的枯草芽孢杆菌WB800属于微生物发酵和酶工程技术领域长期使用的安全菌株，无毒无害；另外，发酵周期短，发酵液壳聚糖酶活力达到45U/mL，离心分离获得的粗酶液可直接应用于壳寡糖的生产。

技术领域

本发明涉及微生物发酵和酶工程技术领域，尤其涉及一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚糖酶的方法。

背景技术

壳聚糖酶可用于食品工业，将壳聚糖水解成壳寡糖。壳寡糖是甲壳素、壳聚糖产品的升级产品，具有壳聚糖不可比拟的优越性。它具有分子量低、水溶性好、功能作用大、易被人体吸收、生物活性高等优势，在医药、食品、农业、环境及水处理等领域具有广泛的应用前景。关于产壳聚糖酶的菌种来源，国内外大多数从自然界中筛选诱变得到，但发酵产酶活性普遍不高。有些菌株本身的安全性也有待深入研究。枯草芽孢杆菌属于微生物发酵和酶工程技术领域长期使用的安全菌株，无毒无害，用于发酵生产壳聚糖酶已经有一些报道。但枯草芽孢杆菌本身会分泌表达大量的蛋白酶，从而对发酵液中的壳聚糖酶进行降解，使其逐渐失去活性。

中国专利CN107236721A提供了一种枯草芽孢杆菌壳聚糖酶及其制备方法和应用，根据毕赤酵母密码子的偏好性，对枯草芽孢杆菌的壳聚糖酶编码基因进行了优化，进一步利用毕赤酵母表达系统对该所述优化的壳聚糖酶编码基因进行高效分泌表达，获得枯草芽孢杆菌壳聚糖酶。该方法避免了芽孢杆菌本身分泌表达的蛋白酶对壳聚糖酶的降解，但是需要利用转基因微生物进行生产。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚糖酶的方法，所述的蛋白酶缺失微生物是枯草芽孢杆菌WB800，保藏于江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心，CICIM编号为B0132，所述方法包括以下步骤：

S1：菌种活化

将所述枯草芽孢杆菌WB800接种于活化培养基平板，置于培养箱内倒置培养以活化菌株；

S2：种子培养

挑取步骤S1活化后的单菌落接种于种子培养基，置于摇床震荡培养至种子液的OD₆₀₀ 达到0.6~1.0；

S3：发酵产酶

将步骤S2中的种子液接入发酵培养基中，置于摇床震荡培养；

S4：离心分离

将步骤S3发酵后的产物进行离心，收集上清液，获得壳聚糖酶的粗酶液。

其中，所述种子液按体积百分比1.5~3% 的接种量接入所述发酵培养基中。

其中，步骤S1中所述活化培养基的配方为：胰蛋白胨8~12 g/L，酵母提取物3~7 g/L，氯化钠7~11g/L，琼脂粉15~20 g/L，用氢氧化钠调节所述活化培养基的pH为7.2~7.6。

优选地，所述活化培养基的配方为：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉20 g/L，用氢氧化钠调节所述活化培养基的pH为7.4。

其中，步骤S2中所述种子培养基的配方为：胰蛋白胨8~12 g/L，酵母提取物3~7 g/L，氯化钠7~11g/L，用氢氧化钠调节所述种子培养基的pH，使其达到7.2~7.6。