[发明专利]一种维持稳定性、高滴度病毒抗原生产的悬浮细胞病毒的培养方法

说明书

本发明提供了一种维持病毒抗原生产稳定性，提高病毒有效含量的悬浮细胞病毒的培养方法，该方法在细胞培养阶段使用无血清培养方法，一次换液后降低了细胞代谢物对细胞生长的影响及后期病毒生产的干扰，换液后加入硫酸葡聚糖等有效起到提高病毒感染敏感性及细胞分散的作用，后期接毒换液体系中加入PEG6000及高钙溶液提高了接毒效率并大幅增加了口蹄疫病毒的稳定性。制备的病毒液滴度可高达10^7.0‑10^9.01ogTCID₅₀/mL，完全抗原146S含量可达6ug/ml以上且培养的口蹄疫病毒更稳定。

技术领域

本发明属于细胞的培养和维持，以及病毒抗原的制备领域，特别涉及维持稳定性、高滴度病毒抗原生产的悬浮细胞病毒的培养方法、培养的病毒、制备含该病毒抗原的疫苗组合物。

背景技术

利用动物细胞培养技术生产病毒的过程是指使用液体培养基在特定容器中大规模培养动物细胞,然后接入病毒使其在细胞中大量增殖的过程。1928年，Maitland创建利用组织培养的方法体外繁殖病毒的技术。1949年Enders利用Hela细胞体外培养脊髓灰质炎病毒并进行疫苗生产,这标志着动物细胞培养技术正式应用于疫苗生产领域。1962年,Capsti等将BHK贴壁细胞驯化为生长稳定、对口蹄疫病毒敏感的BHK悬浮细胞,这使得悬浮培养技术首次成功应用于兽用疫苗生产。1965年,Telling等首先尝试将基于BHK悬浮细胞的大规模生物反应器体系(30L)应用于口蹄疫疫苗工业化生产。1985年,悬浮培养工艺己成为口蹄疫疫苗生产中普遍采用的方法。生产能力上,口蹄疫疫苗生产企业的制造工艺也在不断升级。早在十年前,英国Wellcome公司就已成功将生产规模扩大到5000L。目前,20000L生物反应器已经投入使用,将显著降低生产成本并提高疫苗产品的生产质量。2011年由我国农业部发布的第1708号公告中己明确指出,自2012年起采用滚瓶等传统方式生产的兽用疫苗生产线将停止受理GMP验收的申请。凭借细胞生长环境均一、培养操作简单可控、大规模体系中容易放大、清洁、对环境损害较小和生产成本较低等优势,悬浮细胞培养必将成为未来产业发展的新方向。

但是，伴随着BHK悬浮细胞大规模培养在病毒培养工业化上的应用，一些问题也随之放大，其中最突出也最具有迷惑性的现象就是BHK悬浮细胞在病毒培养上病毒数量、质量高低与培养细胞的密度、状态关系不稳定。往往细胞生长状态良好但会出现培养出的病毒质量较差的现象发生。就此国内外大量的科研院所与疫苗生产企业都做了大量的研究工作，目前较为普遍的解决手段主要有调整接毒量，调整接毒时间，更换培养基等几类，然而目前尚没有一个系统、稳定、符合大规模生产条件的可行解决方法。

现有技术主要问题在于，细胞培养与病毒培养割离评判，现有技术主要将精力放在前期细胞培养的培养密度及细胞生长状态上了，然而实际情况是细胞密度高时病毒培养后病毒量并不一定多。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种维持稳定性、高滴度病毒抗原生产的悬浮细胞病毒的培养方法，其中，所述方法包括：步骤(1)将悬浮细胞进行稀释传代，培养，使得悬浮细胞处于传代后细胞密度为0.5×10⁶-0.6×10⁶cells/ml，得到悬浮细胞种子；步骤(2)在生物反应器中接入所述步骤(1)中所述悬浮细胞种子，培养至所述悬浮细胞密度达到≥1-2×10⁶cells/毫升；步骤(3)从所述步骤(2)中所述细胞密度达到1-2×10⁶cells/ml时的悬浮细胞分离掉培养基，替换加入无血清DMEM/F12培养基进行重悬，所述无血清DMEM培养基由以下组分组成：DMEM/F12液体培养基，pH为7.0～7.2，含有1-3μg/ml胰岛素、1～10μg/ml转铁蛋白、0.2～0.8μg/ml硫酸葡聚糖；步骤(4)培养所述悬浮细胞，使其适应所述无血清DMEM培养基生长环境，之后，加入终浓度0.01-0.3％v/v的PEG6000，再按MOI＝0.01-0.1接种口蹄疫病毒；以及步骤(5)继续培养，加入CaCL₂溶液，终浓度为6-12mM。培养，收毒。