[发明专利]一种维持稳定性、高滴度病毒抗原生产的悬浮细胞病毒的培养方法

权利要求书

1.一种维持稳定性、高滴度病毒抗原生产的悬浮细胞病毒的培养方法，其中，所述方法包括：

步骤（1）将悬浮细胞进行稀释传代，培养，使得悬浮细胞处于传代后细胞密度为0.5×10⁶-0.6×10⁶cells/ml，得到悬浮细胞种子，所述悬浮细胞为BHK-21细胞；

步骤（2）在生物反应器中接入所述步骤（1）中所述悬浮细胞种子，培养至所述悬浮细胞密度达到≥1×10⁶cells /ml；

步骤（3）从所述步骤（2）中所述细胞密度达到1×10⁶-2×10⁶ cells /ml时的悬浮细胞分离掉培养基，替换加入无血清DMEM培养基进行重悬，所述无血清DMEM培养基由以下组分组成：

DMEM/F12液体培养基，pH为7.0～7.2，1-3μg/ml胰岛素、1～10μg/ml转铁蛋白、0.2～0.8μg/ml硫酸葡聚糖；

步骤（4）培养所述悬浮细胞，使其适应所述无血清DMEM培养基生长环境，之后，加入终浓度0.01-0.3%v/v的PEG6000，再按MOI＝0.01-0.1接种口蹄疫病毒；以及

步骤（5）继续培养，加入CaCL₂溶液，终浓度为6-12mM，培养，收毒。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其中，所述步骤（1）的培养悬浮细胞的培养基为无添加DMEM/F12培养基；所述步骤（2）的培养基为无添加DMEM/F12培养基。

3.根据权利要求1所述的培养方法，其中，所述步骤（1）中将能稳定传代的BHK-21悬浮细胞稀释计数，将处于冻存前处于对数生长期的细胞悬液按密度0.5×10⁶-0.6×10⁶cells/ml接种到125ml摇瓶，摇瓶放置在37℃、5%CO₂培养箱中进行培养,105r/min搅拌；每隔48h取样计数,并进行稀释传代，传代后细胞密度控制在0.5×10⁶-0.6×10⁶cells/ml。

4.根据权利要求1所述的培养方法，其中，所述步骤（2）中在生物反应器中接入驯化后的种子细胞，初始密度0.5×10⁶cells/ml，种子细胞的活力高于95％，反应器参数设定为：转速为80转/分，培养温度为37℃，溶氧为30％-45％，pH值为7.2-7.4；悬浮培养BHK-21细胞，细胞密度达到≥4.5×10⁶ cells /ml，稀释细胞密度达到≥1×10⁶cells/ml时进行换液。

5.根据权利要求1所述的培养方法，其中，所述步骤（3）中的所述替换加入的无血清DMEM培养基为整个体系的90%。

6.根据权利要求1所述的培养方法，其中，所述步骤（3）中的所述悬浮细胞在稀释至1×10⁶-2×10⁶cells/ml时停止搅拌，生物反应器中自然沉降6-8小时，弃去90%上清培养基，使用所述无血清DMEM培养基进行重悬。

7.根据权利要求1所述的培养方法，其中，所述步骤（4）中所述接种的口蹄疫病毒为A型、O型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型、或ASIA1型口蹄疫病毒。

8.根据权利要求7所述的培养方法，其中，所述步骤（4）中所述接种的口蹄疫病毒为ONXC/92株。

9.根据权利要求1所述的培养方法，其中，所述步骤（4）中当生物反应器中BHK-21细胞的浓度高于450万/mL时，加入PEG6000终浓度达到0.01-0.3%v/v；按MOI＝0.01-0.1接种口蹄疫毒；生物反应器设定参数为：转速80转/分钟，DO值50％，温度为37℃。