[发明专利]一种基于微量法的叶绿体复合体Ⅴ活性测定试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种基于微量法的叶绿体复合体Ⅴ活性测定试剂盒及方法，该试剂盒包括试剂一（Tris‑HCl、蔗糖、EGTA）、试剂二（ATP）、试剂三（Tris‑HCl、MgCl₂、KCl、NaCl）、试剂四（TCA）、试剂五（ASA）、试剂六（钼酸铵）、试剂七（硫酸、水）。本发明首次建立了包含叶绿体中复合体Ⅴ提取和活性检测的方法，其原理为复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性；发明通过合理设置对照管，可以排除杂质影响，检测专一性极高；本发明能够有效分离胞浆蛋白、线粒体蛋白和叶绿体蛋白，准确测定位于叶绿体中的复合体Ⅴ活性。本发明重复性较好，变异系数在2％以内。

技术领域

本发明属于生命科学领域，具体涉及一种基于微量法的叶绿体复合体Ⅴ活性测定试剂盒及方法。

背景技术

叶绿体复合体Ⅴ又称F₁F₀-ATP合酶，该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。目前，测定线粒体复合体Ⅴ活性的方法鲜有报道，但尚未发现有效的检测叶绿体复合体Ⅴ活性的测定方法。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明旨在提供一种基于微量法的叶绿体复合体Ⅴ活性测定试剂盒及方法，具有检测专一性极高，检测准确度高，重复性较好等特点。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种基于微量法的叶绿体复合体Ⅴ活性测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：

试剂一，液体100mL×1瓶，由Tris-HCl、蔗糖、EGTA混合而成，-20℃保存；

试剂二，粉剂×1支，由ATP组成，置于2mL EP管中，-20℃保存；

试剂三，液体8mL×1瓶，由Tris-HCl、MgCl₂、KCl、NaCl混合而成，4℃保存；

试剂四，粉剂×1瓶，由TCA组成，置于5mL试剂瓶中，4℃保存；

试剂五，粉剂×1瓶，由ASA组成，置于10mL试剂瓶中，4℃保存；

试剂六，粉剂×1瓶，由钼酸铵组成，置于10mL试剂瓶中，4℃保存；

试剂七，液体10mL×1瓶，由硫酸和水混合而成，置于10mL试剂瓶中，室温保存。

进一步的，所述试剂一中所含的Tris-HCl的物质的量浓度为50mM，pH为7.4，体积为100mL，蔗糖的质量为10.96g，EGTA的质量为380mg。

进一步的，所述试剂二中所含的ATP的质量为36.3mg。

进一步的，所述试剂三中所含的Tris-HCl的物质的量浓度为50mM，pH为7.2，体积为8mL，MgCl₂的质量为61mg， KCl的质量为60mg，NaCl的质量为47mg。

进一步的，所述试剂四中所含的TCA的质量为0.8g。

进一步的，所述试剂五中所含的ASA的质量为1g。

进一步的，所述试剂六中所含的钼酸铵的质量为0.25g。

进一步的，所述试剂七中所含的硫酸的体积为1.4mL，水的体积为8.7mL。

一种利用上述试剂盒的基于微量法的叶绿体复合体Ⅴ活性测定方法，其原理为复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性；

本发明首次建立了包含叶绿体中复合体Ⅴ提取和活性检测的方法，其具体步骤如下：