[发明专利]一种基于微量法的叶绿体复合体Ⅴ活性测定试剂盒及方法

权利要求书

1.一种基于微量法的叶绿体复合体Ⅴ活性测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：

试剂一，液体100mL×1瓶，由Tris-HCl、蔗糖、EGTA混合而成，-20℃保存；

试剂二，粉剂×1支，由ATP组成，置于2mL EP管中，-20℃保存；

试剂三，液体8mL×1瓶，由Tris-HCl、MgCl₂、KCl、NaCl混合而成，4℃保存；

试剂四，粉剂×1瓶，由TCA组成，置于5mL试剂瓶中，4℃保存；

试剂五，粉剂×1瓶，由ASA组成，置于10mL试剂瓶中，4℃保存；

试剂六，粉剂×1瓶，由钼酸铵组成，置于10mL试剂瓶中，4℃保存；

试剂七，液体10mL×1瓶，由硫酸和水混合而成，置于10mL试剂瓶中，室温保存。

2.根据权利要求1所述的基于微量法的叶绿体复合体Ⅴ活性测定试剂盒，其特征在于：所述试剂一中所含的Tris-HCl的物质的量浓度为50mM，pH为7.4，体积为100mL，蔗糖的质量为10.96g，EGTA的质量为380mg。

3.根据权利要求1所述的基于微量法的叶绿体复合体Ⅴ活性测定试剂盒，其特征在于：所述试剂二中所含的ATP的质量为36.3mg。

4.根据权利要求1所述的基于微量法的叶绿体复合体Ⅴ活性测定试剂盒，其特征在于：所述试剂三中所含的Tris-HCl的物质的量浓度为50mM，pH为7.2，体积为8mL，MgCl₂的质量为61mg， KCl的质量为60mg，NaCl的质量为47mg。

5.根据权利要求1所述的基于微量法的叶绿体复合体Ⅴ活性测定试剂盒，其特征在于：所述试剂四中所含的TCA的质量为0.8g。

6.根据权利要求1所述的基于微量法的叶绿体复合体Ⅴ活性测定试剂盒，其特征在于：所述试剂五中所含的ASA的质量为1g。

7.根据权利要求1所述的基于微量法的叶绿体复合体Ⅴ活性测定试剂盒，其特征在于：所述试剂六中所含的钼酸铵的质量为0.25g。

8.根据权利要求1所述的基于微量法的叶绿体复合体Ⅴ活性测定试剂盒，其特征在于：所述试剂七中所含的硫酸的体积为1.4mL，水的体积为8.7mL。

9.一种利用如权利要求1所述的试剂盒的基于微量法的叶绿体复合体Ⅴ活性测定方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤1 仪器和用品的准备；

准备可见分光光度计或酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿或96孔板、研钵、冰、蒸馏水；

步骤2 试剂的配制；

在存放有试剂二的试剂瓶中加入2mL蒸馏水，充分溶解，制得试剂二溶液备用；

在存放有试剂四的试剂瓶中加入4mL蒸馏水，充分溶解，制得试剂四溶液备用；

在存放有试剂五的试剂瓶中加入10mL蒸馏水，充分溶解，制得试剂五溶液备用；

在存放有试剂六的试剂瓶中加入10mL蒸馏水，充分溶解，制得试剂六溶液备用；

按蒸馏水：试剂五溶液：试剂六溶液：试剂七溶液=2:1:1:1的体积比配制定磷试剂，配好的定磷试剂应为浅黄色，若为无色则试剂失效，若为蓝色则为磷污染；

步骤3 叶绿体的提取；

称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一，用研钵匀浆，快速研磨或捣碎，30秒内完成，使之成为匀浆液；

将匀浆液于离心率200g，4℃下离心1min；

弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，离心率1500g，4℃下离心5min；

弃上清液，于沉淀中加入0.5mL试剂一，混匀，配成叶绿体悬浮液；

步骤4 叶绿体复合体Ⅴ活性的测定操作；

酶促反应：

1）取2支EP管，分别设定为第一对照管和第一测定管；

2）在第一对照管中加入10μL试剂二溶液和40μL试剂三，同时在第一测定管中加入50μL样本提取液、10μL试剂二溶液和40μL试剂三；

3）分别将第一测定管和第一对照管混匀，在37℃或25℃准确水浴30min；

4）在第一对照管中加入20μL试剂四溶液和50μL样本提取液，同时在第一测定管中加入20μL试剂四溶液；

5）分别将第一测定管和第一对照管混匀，用离心率4000g，25℃离心10min，取上清液；

b.定磷；

1）另取2支EP管，分别设定为第二对照管和第二测定管；

2）在第二对照管中加入30μL第一对照管中的上清液和170μL的定磷试剂；同时在第二测定管中加入30μL第一测定管中的上清液和170μL的定磷试剂；

3）分别将第二对照管和第二测定管混匀，室温静置10min后，在660nm波长处分别读取测定管的吸光值A_测定管和对照管的吸光值A_对照管；

4）计算ΔA = A_测定管- A_对照管；

步骤5 叶绿体复合体Ⅴ活性的计算；

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

标准条件下测定的回归方程为y = 1.274x + 0.004；

其中，x为标准品浓度，单位为mmol/L，y为吸光值，y=ΔA；

1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol无机磷定义为一个酶活性单位；此法需要自行测定样本蛋白质浓度；

复合体Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.004)÷1.274×V_反总×10⁶]÷(V_样×Cpr)÷T=62.8×(ΔA-0.004)÷Cpr；

2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟产生1 nmol无机磷定义为一个酶活性单位；

复合体Ⅴ活性（nmol/min /g 鲜重）=[(ΔA-0.004)÷1.274×V_反总×10⁶]÷(W×V_样÷V_样总)÷T=31.37×(ΔA-0.004)÷W；

3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位；

复合体Ⅴ活性（nmol/min /10⁴ cell）=[(ΔA-0.004)÷1.274×V_反总×10⁶]÷(500×V_样÷V_样总)÷T=0.063×(ΔA-0.004)；

其中，V_样=0.05mL，表示加入样本体积；

V_样总=0.5mL，表示加入提取液体积；

V_反总=1.2×10^-4 L，表示反应体系总体积；

T=30 min，表示反应时间；

Cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/mL；

W表示样本质量，单位为g；

500表示细菌或细胞总数500万；

b.使用96孔板测定的计算公式如下：

标准条件下测定的回归方程为y = 0.637x + 0.004；

其中，x为标准品浓度，单位为mmol/L，y为吸光值，y=ΔA；

1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位；此法需要自行测定样本蛋白质浓度；

复合体Ⅴ活性（nmol/min /mg prot）=[(ΔA-0.004)÷0.637×V_反总×10⁶]÷(V_样×Cpr)÷T=125.6×(ΔA-0.004)÷Cpr；

2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟产生1 nmol无机磷定义为一个酶活性单位；

复合体Ⅴ活性（nmol/min /g 鲜重）=[(ΔA-0.004)÷0.637×V_反总×10⁶]÷(W×V_样÷V_样总)÷T=62.74×(ΔA-0.004)÷W；

3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位：

复合体Ⅴ活性（nmol/min /10⁴cell）=[(ΔA-0.004)÷0.637×V_反总×10⁶]÷(500×V_样÷V_样总)÷T=0.126×(ΔA-0.004)；

其中，V_样=0.05 mL，表示加入样本体积；

V_样总=0.5 mL，表示加入提取液体积；

V_反总=1.2×10-4 L，表示反应体系总体积；

Cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/mL；

W表示样本质量，单位为g；

500表示细菌或细胞总数500万；

T=30 min，表示反应时间。