[发明专利]一种牛腱来源的高纯度胶原蛋白海绵的制备方法

说明书

本发明属于医学生物材料技术领域，具体涉及一种以动物跟腱为原材料制作Ⅰ型胶原海绵的方法，其主要特征在于制备的胶原海绵是以三螺旋结构的形式存在。利用酸膨胀—胃蛋白酶降解的新方法提取低免疫原性的胶原蛋白，再利用盐析及透析等纯化方法得到高蛋白含量、高纯度的Ⅰ型胶原蛋白。最后利用交联、冻干成型、数次清洗、二次冻干及辐照灭菌等过程得到具有一定机械强度、有一定的透湿性、具有适宜的孔径与孔隙率以及无菌的三维结构的医用胶原蛋白海绵。本发明获得的高纯度Ⅰ型胶原蛋白海绵，可广泛应用于医药领域(如组织修复)。

技术领域

本发明涉及胶原蛋白的纯化及海绵的制备方法。

背景技术

胶原蛋白是细胞外基质的重要组成部分，是形成器官和组织必不可少的成分，广泛分布于哺乳动物的各组织器官中。胶原蛋白由两条α1(Ⅰ)链和一条α2(Ⅰ)链组成，有时两条α链会彼此重叠形成一条β链，或者三条α链彼此重合形成一条γ链，具有三螺旋结构。胶原蛋白海绵是胶原蛋白的一种物理形式，是经过冷冻干燥的技术得到的三维海绵结构，冷冻干燥技术很好的保持了胶原蛋白固有的三螺旋结构。利用胃蛋白酶对动物跟腱进行酶解，作用于胶原N一端3/4处，切掉胶原端肽而保留三股螺旋区段并降低胶原蛋白的免疫原性。胶原蛋白有很多功能，外源性的胶原蛋白组织工程材料在组织创伤止血、修复、缺损填充等方面发挥着巨大的作用。

到目前为止，已经发现胶原类型29种，研究得较为多的是I-Ⅴ型胶原，其中以I型胶原含量最多，约占生物体总胶原的90％，应用也最为广泛。Ⅰ型胶原是纤维形成胶原，能活化上皮细胞，是促进生皮细胞增生，也可促进胶原酶生成，使皮肤有张力和弹力，因此在在医药领域用于修复皮肤创伤和骨结构损伤越来越引起了人们的关注。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简易工艺得到高纯度、对机体无毒害、止血性和组织修复性能的医用牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白海绵。

本发明所采用技术方案是：

一种牛腱来源的Ⅰ型胶原蛋白海绵的制备方法，其包括以下步骤：

S1、牛跟腱除脂、除非蛋白成分，取10g前处理物，经绞碎，3％乙酸溶胀48h，加入1％的胃蛋白酶提取48h，经过NaCl盐析，得到胶原蛋白粗沉淀；最后经过乙酸复溶，再分别用0.02M磷酸氢二钠、1％乙酸、0.5％乙酸、0.1％乙酸和蒸馏水透析，得到高纯度Ⅰ型胶原蛋白；

S2、胶原蛋白海绵的成型的交联：利用化学交联法对胶原蛋白进行交联处理、冷冻干燥后成胶原蛋白海绵。

S3、胶原蛋白海绵的灭菌：将步骤2处理过的Ⅰ型胶原蛋白海绵预产品包装后用Co60辐照灭菌，得到胶原蛋白海绵产品。

其中，高纯度胶原蛋白海绵的制备方法包括以下步骤：

SS1、取样：获取新鲜牛跟腱，剔除筋膜，三蒸水清洗干净，晾干，手术刀切薄片，组织匀浆机绞碎；

SS2、除非胶原蛋白：称取60g左右的牛跟腱绞碎物，用生理盐水浸泡4h后，纱布过滤，再用浓度为0.1M的氢氧化钠于4℃冰箱搅拌24h，每12h换一次液；

SS3、除脂肪：绞碎物用纱布过滤，生理盐水多次清洗并过滤至清洗液pH为中性，加入10％的异丙醇在4℃下搅拌24h，每12h换液一次；

SS4、除杂蛋白:再用含有4.5M的氯化钠的0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液反应24h；

SS5、洗涤：用纱布过滤，生理盐水清洗6次；

SS6、酸提:在清洗好的牛跟腱绞碎物中加入少量的3％(0.5M)的乙酸溶液，用组织匀浆机搅拌为粘稠状混合物，再加入1000ml的3％的乙酸溶液于4℃溶胀24h，纱布过滤，取沉淀加入1000ml浓度为0.5M的乙酸继续溶胀24h；