[发明专利]一种牛腱来源的高纯度胶原蛋白海绵的制备方法

权利要求书

1.一种牛腱来源的Ⅰ型胶原蛋白海绵的制备方法，其包括以下步骤：

S1、牛跟腱除脂、除非蛋白成分，取10g前处理物，经绞碎，3％乙酸溶胀48h，加入1％的胃蛋白酶提取48h，经过NaCl盐析，得到胶原蛋白粗沉淀；最后经过乙酸复溶，再分别用0.02M磷酸氢二钠、1％乙酸、0.5％乙酸、0.1％乙酸和蒸馏水透析，得到高纯度Ⅰ型胶原蛋白；

S2、胶原蛋白海绵的成型的交联：利用化学交联法对胶原蛋白进行交联处理、冷冻干燥后成胶原蛋白海绵；

S3、胶原蛋白海绵的灭菌：将步骤2处理过的Ⅰ型胶原蛋白海绵预产品包装后用Co60辐照灭菌，得到胶原蛋白海绵产品。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其包括以下步骤：

SS1、取样：获取新鲜牛跟腱，剔除筋膜，三蒸水清洗干净，晾干，手术刀切薄片，组织匀浆机绞碎；

SS2、除非胶原蛋白：称取60g左右的牛跟腱绞碎物，用生理盐水浸泡4h后，纱布过滤，再用浓度为0.1M的氢氧化钠于4℃冰箱搅拌24h，每12h换一次液；

SS3、除脂肪：绞碎物用纱布过滤，生理盐水多次清洗并过滤至清洗液pH为中性，加入10％的异丙醇在4℃下搅拌24h，每12h换液一次；

SS4、除杂蛋白：再用含有4.5M的氯化钠的0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液反应24h；

SS5、洗涤：用纱布过滤，生理盐水清洗6次；

SS6、酸提：在清洗好的牛跟腱绞碎物中加入少量的3％(0.5M)的乙酸溶液，用组织匀浆机搅拌为粘稠状混合物，再加入1000ml的3％的乙酸溶液于4℃溶胀24h，纱布过滤，取沉淀加入1000ml浓度为0.5M的乙酸继续溶胀24h；

SS5、酶解：纱布过滤，取沉淀，加入含有1％胃蛋白酶的0.5M乙酸1000ml，4℃下搅拌24h。纱布过滤，收集上清溶胀液，取沉淀继续加酶解液酶解24h，；

SS6、取酶解液：酶解混合液纱布过滤，收集上清并与上批酶解液混合。

SS7、调pH：用1M氢氧化钠调节酶解上清液pH为7.0；

SS8、盐析：向中性溶胀液中缓慢加入终浓度为2.7M的NaCl细颗粒，边加边搅拌，随后于4℃静置过夜；

SS9、收集胶原蛋白：纱布过滤去上清，得白色沉淀；

SS10、透析：0.5M乙酸重新溶解胶原蛋白沉淀，装入透析袋先分别以1％、0.5％、0.01％的乙酸为透析外液分别透析24h，再以0.02M的磷酸氢二钠作为透析外液透析24h，最后用三蒸水透析72h，每12h换液；

SS11、交联：向透析后的胶原蛋白溶液中加入终浓度为0.05％的戊二醛，搅拌10分钟，倒入直径为10cm的细胞培养皿中，每个模具30g胶原蛋白，4℃平面静置交联4h，然后转移至-20℃冰箱，冷冻8-12h；

SS12、冻干：于提前预冷的-58℃真空冷冻干燥机中干燥36-48h；

SS13、清洗：干燥后的胶原蛋白海绵用三蒸水清洗8-10遍，每遍10min；

SS14、二次冻干：清洗后的海绵于-20℃冷冻4-6h，然后冷冻干燥16-24h；

SS15、灭菌：包装后用Co60辐照灭菌。