[发明专利]构建测序文库的方法、试剂盒、上机方法及测序数据的拆分方法

说明书

本发明提供了一种构建测序文库的方法、试剂盒、上机方法及测序数据的拆分方法。试剂盒包括多个分子标签接头组和多个I5‑index引物序列及多个I7‑index引物序列，每个分子标签接头组包括多个分子标签接头，每个分子标签接头包含分子标签序列，任意两个分子标签接头上的分子标签序列不同、任意两个I5‑index引物序列上的index不同，任意两个I7‑index引物序列上的index不同。通过包含多组分子标签接头组及多组I5/I7Index引物序列组，能够利用分子标签接头和I5Index和I7Index三个标签共同标记样本，实现了更高的平行上机通量。

技术领域

本发明涉及高通量测序技术领域，具体而言，涉及一种构建测序文库的方法、试剂盒、上机方法及测序数据的拆分方法。

背景技术

第一代测序技术的主要特点是测序读长长，准确性高，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。近年来，二代测序技术逐渐成熟，其具有通量高，速度快，测序成本低等优势，在科研上和临床上的应用也越来越广泛。

提升测序效率的迫切需求促使了多样品混合测序的快速普及，随着HiSeq 3000/4000， HiSeq X Ten和NovaSeq等型号仪器的面世，对平行上机的文库通量提出了更高的要求。根据测序数据量的不同，NovaSeq可以同时上机几百甚至上千个样本。传统的单端index标签已经不能满足测序样本的平行上机需求，越来越多的人们转向了双端Index组合，M条I5Index 和N条I7Index可以实现MxN个文库的平行上机。这样的组合应用看上去突破了通量的限制，但后期的应用发现了新的问题。

2017年初，美国Standford大学的科研工作者Sinha，利用illumina Hiseq 4000对RNA样本进行测序，41个独特的细胞亚群被认为是造血干细胞群，但难以重复的实验结果使他发现，那些“激动人心的结果”只不过是在illumina ExAmp平台的交叉污染产生的“镜花水月”。相同的文库用Nextseq 500进行测序，大部分交叉污染消失了，那些“激动人心的结果”也再没有重复出来。今年4月份，illumina公布了题为“Effects of IndexMisassignment on Multiplexing and Downstream Analysis”的白皮书，坦陈了illumina一些高通量型号，如HiSeq 3000/4000， Hiseq X Series及NovaSeq等仪器，容易出现样品标签错配(index misassignment)的问题，而这些仪器的共同点在于，都采用了新型的以Nano-Well为特点的Patterned Flow Cell Technology(PFCT)，簇生成方式也有别于传统的桥式PCR，换成了ExAmp(Exclusion Amplification，排他性扩增)。白皮书上提出了一个过滤Index跳跃的数据的解决方案，就是使用特异性的双端Index(Unique-Dual-Index)，即每个文库既要有特异的I5Index还要有特异的 I7Index。但这样能平行上机文库数量不再是MxN(I5端Index数量为M，I7端Index数量为 N)，而是只能上机n个样本(n为M和N中的最小值)。在保证编辑距离的前提下，按照目前主流的设计Index长度为8nt，只能设计出约400对特异性的双端Index。如何能进一步扩展 Index的数量，是否有其他更好的方案来替代特异性双端Index，是一个高通量测序时代亟待解决的问题。

而且，随着二代测序技术的发展，以血液为检材的液体活检，凭借无创、便捷等优势在临床应用中展现出广大前景。与现有肿瘤检测方法相比，液体活检无侵入性、可频繁多次检测及快速反应能力均体现出显着的优势。无论是母体血液中的胎源DNA，器官移植患者血液中的移植器官来源的DNA，还是肿瘤患者血液游离ctDNA都只占游离血浆DNA---cfDNA的极少一部分，本来血浆cfDNA的含量就不高，而检测特别关注的信息被大量的cfDNA所稀释，这样对稀有变异的检出的灵敏度提出了更高的要求。