[发明专利]一种利用基因工程菌制备孕烯醇酮的方法

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，且公开了一种利用基因工程菌制备孕烯醇酮的方法，包括以下步骤：S1：首先选择噬菌粒载体，并对其进行去核处理，将全基因合成的生物酶基因片段孕烯醇酮克隆到高效表达载体中，构建了产孕烯醇酮的基因工程载体，通过紫外线光照诱变处理，获得孕烯醇酮氧化酶高产载体；S2：将步骤S1中所得到的产生载体放入培养基中，在10‑20℃的温度下，培养40‑45h；S3：将步骤S2中培养后的载体加入到50ml二颈瓶中，在室温搅拌下加入浓度为85％的NaHCO3溶液，反应3.5h，再加热至100℃，并搅拌。该利用基因工程菌制备孕烯醇酮的方法，解决了现有的生产方法效率低，不能满足生产需求的问题。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种利用基因工程菌制备孕烯醇酮的方法。

背景技术

在肾上腺和性腺中合成的各种类固醇能够调节CNS中的神经元兴奋性。对于这些化合物，已产生术语“刺激神经组织的类固醇”(Majewska等,1986)，或脑可以重新合成的“神经类固醇”(Baulieu,1991)。很久之前就已公认类固醇激素在动物和人类中具有镇静、麻醉和抗咬合的性质(Aird,1944；Aird和Gordan,1951；Gyermek等,1967；Green等,1978)。过去二十年间的研究揭示黄体酮和去氧皮质酮分别充当内源性神经类固醇别孕烯醇酮(5α-孕烷-3α-ol-20-酮)和THDOC(5α-孕烷-3α,21-二醇-20-酮)的前体(Reddy,2003；2009a)。睾丸激素衍生的雄激素例如二氢雄甾酮(5α-雄甾烷-3α,17β-二醇)和雌二醇可以被认为是神经类固醇(Reddy,2008)。通常，神经类固醇的急性效应与和传统的调节基因转录的类固醇激素受体的相互作用无关。此外，神经类固醇本身在胞内类固醇受体中无活性。它们主要通过与神经元的膜受体(主要是GABA-A受体)和离子通道的相互作用调节脑兴奋性(Lambert等,2003；Reddy,2003；Akk等,2009)。现有技术中，孕烯醇酮是一种重要的药物合成中间体，由它能合成大部分甾体激素类药物，在国内它的年产量在1000吨左右，市场需求量较大，现有的生产方法效率低，不能满足生产需求。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种利用基因工程菌制备孕烯醇酮的方法，具备生产效率高的优点，解决了现有的生产方法效率低，不能满足生产需求的问题。

为提高生产效率的目的，本发明提供如下技术方案：一种利用基因工程菌制备孕烯醇酮的方法。

一种利用基因工程菌制备孕烯醇酮的方法，包括以下步骤：

S1：首先选择噬菌粒载体，并对其进行去核处理，将全基因合成的生物酶基因片段孕烯醇酮克隆到高效表达载体中，构建了产孕烯醇酮的基因工程载体，通过紫外线光照诱变处理，获得孕烯醇酮氧化酶高产载体；

S2：将步骤S1中所得到的产生载体放入培养基中，在10-20℃的温度下，培养40-45h；

S3：将步骤S2中培养后的载体加入到50ml二颈瓶中，在室温搅拌下加入浓度为85％的NaHCO3溶液，反应3.5h，再加热至100℃，并搅拌；

S4：将步骤S3中所得到液体中通入乙炔并反应6h，待混合物冷却后，用水稀释，将稀释液用乙醚多次萃取，分液；

S5：将步骤S4中所得到乙醚萃取液进行合并，用蒸馏水反复多次洗涤至无色透明状液体；

S6：将步骤S5中所得到的无色透明状液体加热，并进行旋转蒸发，再除去乙醚，洗出孕烯醇酮与粗产物。

优选的，所述步骤S1中的孕烯醇酮提取包括以下步骤：

B1：将培养12h以上、生长至含有饱和孕烯醇酮液转移到1.5ml离心管中，12000rpm离心1min，收集细胞，再用ddH2O漂洗两次；