[发明专利]一种利用基因工程菌制备孕烯醇酮的方法

权利要求书

1.一种利用基因工程菌制备孕烯醇酮的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：首先选择噬菌粒载体，并对其进行去核处理，将全基因合成的生物酶基因片段孕烯醇酮克隆到高效表达载体中，构建了产孕烯醇酮的基因工程载体，通过紫外线光照诱变处理，获得孕烯醇酮氧化酶高产载体；

S2：将步骤S1中所得到的产生载体放入培养基中，在10-20℃的温度下，培养40-45h；

S3：将步骤S2中培养后的载体加入到50ml二颈瓶中，在室温搅拌下加入浓度为85％的NaHCO3溶液，反应3.5h，再加热至100℃，并搅拌；

S4：将步骤S3中所得到液体中通入乙炔并反应6h，待混合物冷却后，用水稀释，将稀释液用乙醚多次萃取，分液；

S5：将步骤S4中所得到乙醚萃取液进行合并，用蒸馏水反复多次洗涤至无色透明状液体；

S6：将步骤S5中所得到的无色透明状液体加热，并进行旋转蒸发，再除去乙醚，洗出孕烯醇酮与粗产物。

2.根据权利要求1所述的一种利用基因工程菌制备孕烯醇酮的方法，其特征在于：所述步骤S1中的孕烯醇酮提取包括以下步骤

B1：将培养12h以上、生长至含有饱和孕烯醇酮液转移到1.5ml离心管中，12000rpm离心1min，收集细胞，再用ddH2O漂洗两次；

B2：将步骤B1中得到的溶液中加入200μl破菌缓冲液BTEB涡旋混匀，再加入200μl石英砂、200μlEB、200μl酚氯仿，剧烈震荡10min；

B3：将步骤B2中得到的溶液进行12000rpm离心10min，去上层水相转移至新离心管中，加入1/10体积的3M醋酸钠，加入1mL预冷的无水乙醇，翻转混匀，于-20℃静止2h以上；

B4：将步骤B3中得到的溶液在4℃环境下进行12000rpm离心15min，洗净上清，用1mL预冷的70％乙醇漂洗，4℃12000rpm离心1min，重新漂洗一次；

B5：将步骤B4中得到的溶液在37℃培养箱烘干乙醇，视最终碎片量加入50-100μl孕烯醇酮溶解组DNA，对孕烯醇酮进行提取。

3.根据权利要求1所述的一种利用基因工程菌制备孕烯醇酮的方法，其特征在于：所述步骤S2中的培养基通过加入牛肉浸膏0.4g、氨基酸1.2g和无机盐0.5g混合搅拌5min，再加入琼脂2g搅拌2min，静置10min所制备。

4.根据权利要求1所述的一种利用基因工程菌制备孕烯醇酮的方法，其特征在于：所述步骤S4中混合物中含有果冻状物质时，在溶液中加入浓度为90％的碳酸钾溶液，用玻璃板搅拌去除。

5.根据权利要求1所述的一种利用基因工程菌制备孕烯醇酮的方法，其特征在于：所述步骤S6中产生的粗产物用200-300目硅胶进行柱层分离。

6.根据权利要求1所述的一种利用基因工程菌制备孕烯醇酮的方法，其特征在于：所述步骤S6中旋转蒸发的温度为80-90℃，期间使用玻璃棒进行搅拌。