[发明专利]用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物

说明书

本发明属于分子生物学领域，具体涉及用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物及其应用。本发明主要是将该DNA微型条形码引物用于中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的鉴别过程，该过程主要包括DNA微型条形码引物的设计，甲片基因组DNA的提取，DNA微型条形码基因片段的扩增与测序，对测序结果在NCBI中进行BLAST比对，同时构建基于DNA微型条形码的NJ系统树。本发明提供的鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物扩增效率高，特异性强，质量好，测序成功率高，能够准确鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片。

方法领域

本发明属于分子生物学领域，具体而言，本发明涉及用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物。

背景技术

穿山甲片为鲮鲤科动物穿山甲(Manis pentadactyla)的鳞甲，是一种名贵的动物药材，可用于经闭癓瘕、乳汁不通、痈肿疮毒、风湿痹痛、中风瘫痪、麻木拘挛。其中中华穿山甲是我国药典规定的中药穿山甲甲片的唯一正品来源。然而，穿山甲这一古老的哺乳动物，因遭到大肆非法捕猎陷入了濒临灭绝的地步，已被列入我国药用濒危野生动物之一。因中华穿山甲资源极其稀少，而且存量甲片价格昂贵，一些不法商贩往往用家猪蹄甲(Susscrofa domestica)炮制甲片来冒充中华穿山甲炮制甲片。这两种甲片在炮制后的形态、色泽、气味等方面都较为相似，难以通过常规手段区分，从而影响了药材质量及用药安全，给药材市场监管带来了困扰。

DNA条形码技术是通过对生物基因组内一段标准DNA片段进行分析比较来实现物种识别的一种分子鉴定技术，其在动物分类与鉴定中的发展与应用最为迅速与广泛，研究也较为系统和深入。线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因(cytochrome oxidase subunit I，COI)在绝大多数动物物种中具有序列特异性，该序列以每百万年2％的进化速率不断演化，提供了足够的可识别变异信号位点，其中长度约为650bp的片段可作为动物物种鉴定的标准条形码序列。

作为物种鉴定分类的一种新方法，DNA条形码技术有着独特的优势，但也存在一定的局限性。例如，对于经过高温炮制的样本，由于DNA发生降解，采用标准条形码引物很可能无法扩增出标准长度的COI基因片段，也就无法鉴定样本的物种。然而，采用微型条形码技术可以解决这一难题。DNA微型条形码是指长度一般约为200bp的DNA序列，与DNA标准条形码(一般超过500bp)相比，DNA微型条形码更容易从DNA降解样本中扩增获得。

中国专利申请CN 108103217 A公开了一种快速鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码引物、DNA条形码、试剂盒、方法和应用，该方法包括提取全基因组DNA，设计引物，进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化，测序，将测序结果进行拼接，比对等，该方法可以快速鉴别普洱茶发酵菌株食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007，但是，该方法共涉及四条DNA条形码引物，这在一定程度上增加了试验操作的难度，而且扩增后还需要将四段序列进行拼接，操作过程复杂，也增加了鉴别过程中出错的概率，而且，该方法只适用于鉴别真菌。

因此，现有技术中利用DNA标准条形码鉴别炮制样品时普遍存在DNA降解问题，而且鉴别过程中操作复杂，出错概率提高，因此应用范围窄，成本高。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的缺点，提供一种中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码鉴别方法，该方法主要针对难以获得全长DNA序列的炮制类动物中药材，操作过程简单，不易出错，能够扩大DNA条形码技术的应用范围。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：