[发明专利]用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物

权利要求书

1.用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物，其特征在于，包括特异性的COI-L 191引物对和特异性的COI-L 197引物对，其中，特异性COI-L 191引物对包括COI-L191-F上游引物和COI-L191-R下游引物，所述COI-L 197引物对包括COI-L197-F上游引物和COI-L197-R下游引物，上述引物的核苷酸序列分别为：

COI-L191-F上游引物：5'-AAAAAGGTTGTRTTYAGGTTGCG-3'，

COI-L191-R下游引物：5'-AAATTAATAGCCCCTAGRATTGA-3'；

COI-L197-F上游引物：5'-AAATTAATAGCCCCTAGRATTGA-3'，

COI-L197-R下游引物：5'-AGTAGTCAGAAACTTATGTT-3'。

2.一种如权利要求1所述的用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物在鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

S1、基于中华穿山甲和家猪的COI基因，设计特异性微型引物，得特异性COI-L191引物对，COI-L 197引物对；

S2、提取中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片样品DNA，测定DNA的浓度与纯度，得高质量的全基因组DNA；

S3、以步骤S2所得高质量的全基因组DNA为模板，利用步骤S1所得特异性COI-L 191引物对或COI-L 197引物对，进行PCR扩增，得COI基因片段；

S4、将步骤S3所得COI基因片段利用琼脂糖凝胶电泳检测，然后进行双向测序，将测序结果利用Blast和NJ系统树比对，即可。

3.如权利要求2所述的DNA微型条形码引物在鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片中的应用，其特征在于：所述步骤S2中提取中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片样品DNA的具体操作为：

(1)取30-100mg炮制甲片样品，用体积分数为75％的乙醇水溶液除去表面杂质，剪碎后加入炮制甲片样品体积6倍的裂解缓冲液，得裂解液样品；

(2)向步骤(1)所得裂解液样品中加入10-30mg/mL蛋白酶K溶液，混匀，于50℃-60℃条件下放置2-4h，得混合液I；

(3)向步骤(2)所得混合液I中加入200μL体积分数为0.5％-1.0％的十二烷基硫酸钠水溶液，混匀，于50℃-75℃条件下放置30-60min，加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀10-30s，得带絮状沉淀的混合液；

(4)将步骤(3)所得带絮状沉淀的混合液加入硅胶膜吸附柱中，离心20-40s后弃掉废液，向吸附柱中加入500μL缓冲液，离心20-40s，弃掉废液，向吸附柱中加入600μL体积分数为70％的乙醇水溶液，离心20-40s后弃掉废液，再次离心1-4min后弃掉废液，静置1-5min，得絮状沉淀；

(5)向步骤(4)所得絮状沉淀中加入50-200μL 10-200mM Tris-HCl缓冲液，室温放置1-5min后离心1-4min，即得。

4.如权利要求2所述的DNA微型条形码引物在鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片中的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的裂解缓冲液由10-200mM Tris-HCl和25-100mM EDTA组成。

5.如权利要求2所述的DNA微型条形码引物在鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片中的应用，其特征在于，所述步骤(4)，步骤(5)中的离心条件为10000rpm-14000rpm。

6.如权利要求2所述的DNA微型条形码引物在鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片中的应用，其特征在于：所述步骤S2中测定DNA浓度是采用紫外分光光度计或酶标仪检测DNA溶液在260nm处的吸光值；所述测定DNA纯度是采用紫外分光光度计或酶标仪检测DNA溶液在260nm和280nm处的吸光值。