[发明专利]细胞培养物蛋白质表达量和蛋白质聚集体量的检测方法

说明书

本发明涉及蛋白质检测技术领域，尤其是涉及一种细胞培养物蛋白质表达量和蛋白质聚集体量的检测方法和系统。所述检测方法包括如下步骤：细胞培养物经串接的亲和色谱柱和体积排阻色谱柱进行梯度洗脱和检测；梯度洗脱的流动相包括：流动相A：10‑200mM磷酸二氢钠‑磷酸氢二钠混合物，50‑500mM氯化钠，pH 6.8±0.5；流动相B：10‑200mM甘氨酸，20‑300mM氯化钠，pH 2.5±0.5。本发明的检测方法，将亲和色谱柱和体积排阻色谱柱串接，采用一定的流动相进行梯度洗脱，能够同时检测细胞培养物中蛋白质表达量和聚集体百分比，简便、易用、费用低廉，且结果可靠。

技术领域

本发明涉及蛋白质检测技术领域，尤其是涉及一种细胞培养物蛋白质表达量和蛋白质聚集体量的检测方法和系统。

背景技术

现代生物工程多采用哺乳动物细胞，以液体悬浮法生产蛋白质药物，细胞培养液中的蛋白质的表达量随培养时间发生变化，在培养后期需要频繁取样监控以寻找投入和产出的最佳平衡点；但常用的亲和高效液相色谱法测定蛋白质表达量，其测定的蛋白质表达量是包含蛋白质的聚集体形态、单体形态和含有Fc的片段的加和值，而一般只有单体形态的蛋白质才是所需的，因此这种方法测定的结果不是准确的目标分子(单体形态)的表达量。此外，在细胞培养过程中，细胞分泌的蛋白质分子由于所处的液体环境、机械环境和分子自身物理化学属性等，会发生不同程度的聚集，这对于蛋白质的生产是不期望发生的，会影响工艺的收率和产品质量，因此监控培养物中蛋白质的聚集体百分比也是评价培养工艺的重要参数。此外，在进行细胞株开发时，不同克隆表达的蛋白质聚集体百分比和表达量是衡量所筛选细胞株的重要指标，这也需要一种简便可靠的方法对蛋白质的表达量和纯度进行检测。

传统的分析技术由于细胞培养物中的氨基酸、维生素、宿主蛋白、DNA 等成分的存在，会干扰目标蛋白的检测，所以无法直接测定细胞培养物中蛋白质的聚集体百分比，测定聚集体百分比需要首先使用亲和色谱柱对细胞培养上清待测样品进行纯化，再采用体积排阻-高效液相色谱检测，这种方式存在两种缺点：第一，使用大量的低pH流通相洗脱结合在亲和色谱柱上的目标蛋白时，低pH压力会容易导致样品聚集体的增高，虽然收集洗脱液后可以再对收集物进行pH调节，但pH调节使用的碱性溶液同样因局部溶液不均一导致聚集体进一步可能增高，这些都会导致测试结果不准确；第二：较为耗费人力和珍贵的样品，尤其当待测的细胞培养物样本数量较多、样本体积较少时，这种缺点尤为突出，如在进行细胞株开发时。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种细胞培养物蛋白质表达量和蛋白质聚集体量的检测方法，以解决现有技术中存在的无法准确检测蛋白质表达量以及聚集体百分比。

本发明的第二目的在于提供一种细胞培养物蛋白质表达量和蛋白质聚集体量的检测系统，系统结构简单，操作方便。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

细胞培养物蛋白质表达量和蛋白质聚集体量的检测方法，包括如下步骤：

细胞培养物经串接的亲和色谱柱和体积排阻色谱柱进行梯度洗脱和检测；

梯度洗脱的流动相包括：流动相A：10-200mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠混合物，50-500mM氯化钠，pH 6.8±0.5；流动相B：10-200mM甘氨酸， 20-300mM氯化钠，pH 2.5±0.5。

目前市面上的二维液相色谱是一种可同时测定细胞培养物中蛋白质表达量和聚集体百分比的有效方法，但是这种方法必须采用二维液相色谱仪，其缺点是设备价格高昂、维护较普通液相色谱复杂等，导致方法不容易控制及验证比较难通过，故这些缺点限制了其推广使用。

本发明的检测方法，将亲和色谱柱和体积排阻色谱柱串接，采用一定的流动相进行梯度洗脱，能够同时检测细胞培养物中蛋白质表达量和聚集体百分比，简便、易用、费用低廉，且结果可靠。