[发明专利]一种TOP2A基因的FISH探针的制备方法

说明书

本发明属于生物化学领域，具体属于生物化学相关的测定或检测领域；更具体涉及一种TOP2A基因的FISH探针的制备方法，及由该方法制备出的探针。本发明提供的方法使用BAC克隆、酶切打断以及不对称扩增等方法制备探针文库，使得产品灵敏度、特异性以及信号强度均得到有效提高。

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体属于生物化学相关的测定或检测领域；更具体涉及一种TOP2A基因的FISH探针的制备方法，及由该方法制备出的探针。

背景技术

DNA拓扑异构酶(Topoismoerase,TOP)是细胞内重要的核酶，主要通过催化作用改变DNA的拓扑结构。真核细胞的拓扑异构酶主要分为TOP1和TOP2。其中，在催化过程中形成的中间产物造成DNA双链短暂断裂的称为TOP2。在细胞DNA复制、转录和有丝分裂等重要的生命过程中，TOP2都发挥重要作用。基于对TOP在细胞中关键作用的认识，对该类物质的研究一直是抗肿瘤药物研发的热点之一。目前已上市的拓扑异构酶II抑制剂有依托泊苷、替尼泊苷、多柔比星、伊达比星、表柔比星和米托蒽醌等。

TOP2A的作用在于介导DNA双链解螺旋(断裂和再连接)，其编码的DNA拓扑异构酶Ⅱα(TOPIIα)，具有介导DNA解结或解旋等重要功能，是蒽环类药物和拓扑异构酶抑制剂依托泊苷的重要靶点。TOP2A基因在乳腺癌中的扩增频率约为10％，缺失频率约为3％～12％。

临床研究表明，TOP2A基因异常的患者无复发生存期(RFS)缩短，预后差，尤其是TOP2A基因缺失的患者预后更差；TOP2A基因异常的患者接受蒽环类药物的化疗方案效果要优于TOP2A基因正常的患者，TOP2A异常的患者使用CEF方案(环磷酰胺+表阿霉素+氟尿嘧啶，其中表阿霉素为蒽环类药物)进行治疗可降低65％的复发风险和71％的死亡风险，而TOP2A正常的患者使用此方案只能降低6％的复发风险和10％的死亡风险。因此，检测乳腺癌患者中TOP2A的基因状态对于判断预后、评价药物疗效以及指导临床合理用药有重要意义。

目前在实际应用中，对于TOP2A基因状态检测的常用方法主要有荧光原位杂交法(FISH)和显色原位杂交法(CISH)。FISH法是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在细胞核中或染色体上显示DNA存在与含量的方法。该技术具有快速、安全、灵敏度高以及探针可长期保存等特点，目前已广泛应用于细胞遗传学、肿瘤生物学、基因定位、基因作图、产前诊断及哺乳动物染色体进化研究等领域。CISH法将癌基因探针用地高辛或生物素标记，利用过氧化物酶或碱性磷酸酶的反应使在光学显微镜下检测石蜡组织mRNA的表达水平。虽然这两种均基于原位杂交的原理，但在实际应用中，多以FISH法进行检测。

例如，中国专利申请201510053891.1公开了一种TOP2A基因异常检测探针、试剂盒以及方法，所述试剂盒包括有标记荧光染料的、针对TOP2A基因的第一组探针和针对人类17号染色体着丝粒区域的第二组探针，所述第一组探针对选自SEQ ID NO.41-50中的至少一条探针，所述第二组探针为选自SEQ ID NO.51-60中的至少一条探针；上述两组探针所标记的荧光染料颜色不一样。该申请所提供的TOP2A基因异常检测试剂盒中的FISH探针，不含有重复序列，能够避免交叉反应，与染色体中TOP2A目标检测片段进行识别杂交，具有准确性高，特异性好、及假阳性低的优点。

根据上述申请公开的内容不难看出，其采用的技术思路为：1、涉及扩增引物用于扩增探针并构建探针库(在此步骤中该申请采用常规T-A克隆方式直接对扩增产物进行建库，并未对扩增产物做任何其它处理)；2、将上述探针库标记后直接用于样本检测。