[发明专利]利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法

说明书

本发明涉及一种利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法，属于生物医药技术领域。该方法先采用OCLN慢病毒载体对树鼩骨髓间充干细胞进行感染，然后，加入CD81慢病毒载体继续进行感染，接着，再加入miR‑122慢病毒载体进行感染，感染4h之后，再加入体积是当前培养基体积1/2的含4μg/mL polybrene的新鲜培养基，第二天，去除旧的培养基，换上新鲜培养基继续培养，得到HCV细胞模型，该细胞具有骨髓间充质干细胞的基本特性和分化潜能，并对HCV易感，支持HCV入胞、复制和产出具有感染性的病毒颗粒，为研究HCV的致病机制及药物筛选提供了新的细胞模型资源。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法。

背景技术

丙型肝炎病毒（HCV）是一种正在严重危害人类健康的病毒，目前，全球HCV感染者已达1.7-2.0亿人，每年感染者还在不断递增。HCV感染后，仅有少数（15-25%）的感染者通过自身免疫反应清除病毒，而大多数（75-85%）的感染者发展为慢性感染，其中10-20%感染者发展成肝硬化，肝硬化中约5%患者最后发展为肝癌直至死亡。目前仍然没有疫苗可以预防，尽管已有HCV治疗药物，但其价格极其昂贵，普通患者难于支付。研究HCV的治疗药物、疫苗及发生机制需要适宜的细胞模型和动物模型。

目前HCV细胞模型主要有：淋巴细胞模型、原代肝细胞模型、肝癌细胞系模型和iPS起源的肝样细胞模型。由于HCV在淋巴细胞模型中的复制水平低，细胞系维持时间短，加上这些细胞与肝细胞具有较大的差异，而限制了其应用。原代肝细胞主要有黑猩猩、人胚胎和树鼩原代肝细胞。黑猩猩和人胚胎肝细胞来源有限并受伦理道德影响，重要的是原代肝细胞体外分离繁琐耗时且不能传代培养，培养时间有限，细胞质量和病毒血清质量不易控制，导致其应用受限。

最常用的肝癌细胞模型是基于HCV2a-JFH1-Huh7的细胞模型。尽管利用该模型可以大量复制并产生具有感染性的HCV病毒，但Huh7细胞系是一种肝细胞瘤的衍生细胞株，用其研究的实验结果还需在原代肝细胞和体内进一步验证。由iPS分化的肝样细胞（HLCs）支持1a、1b和2a型HCV感染，有完整的病毒生活周期并产生先天炎症反应（TNF-α和IL-28B分泌），且支持分离自临床病人的1a和1b型HCV感染。但是其产生的具有感染性的病毒颗粒远比Huh-7细胞产生的要低很多，而能分化为支持HCV感染的HLCs的iPS数量也非常少，到目前为止不超过8个细胞系。这些局限性也在一定程度上限制了其应用。所以亟需寻找一种能在体外传代而且能使其产生大量具有感染性HCV病毒颗粒的细胞。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法，该方法选用树鼩骨髓间充质干细胞作为研究细胞，利用骨髓间充质干细胞易于获得及扩增，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能；能够与各种病毒载体结合，进行各种基因的转染，既能保持本身基因的稳定性，还能高效表达所转染基因的特性，将既能促进干细胞向肝细胞分化，又能促进HCV在细胞内感染的miR-122和HCV入胞的两个最为关键的受体CD81和Occludin（OCLN）导入骨髓间充质干细胞，解决了原代肝细胞不能传代和肝癌细胞系研究HCV不足的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法，包括如下步骤：

先采用OCLN慢病毒载体对树鼩骨髓间充干细胞进行感染，然后，加入CD81慢病毒载体继续进行感染，接着，再加入miR-122慢病毒载体进行感染，感染4h之后，再加入体积是当前培养基体积1/2的含2-6μg/mL polybrene的新鲜培养基，第二天，去除旧的培养基，换上新鲜培养基继续培养，得到OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs；之后，将HCVcc病毒接种于OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs中，得到HCV细胞模型；