[发明专利]一种高稳定性Halo-tag探针及其合成和生物应用

说明书

本发明提供了一种高稳定性Halo‑tag探针及其合成和生物应用，该探针为以萘酰亚胺为荧光团，氯代脂肪烃为识别基团设计合成的一种高稳定性的免洗Halo‑tag探针，该探针结构(1)所示，其中，4,5‑位环己二胺的引入增加了染料分子的对称性的同时限制了分子内扭转，使该Halo‑tag探针能够保持高的量子产率与稳定性，在水中量子产率达到0.80以上，荧光半峰宽只有40nm。此外，该类探针能够对活细胞内Halo‑tag特异性标记，实现免洗荧光成像，在单分子检测、超分辨荧光成像等领域有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于荧光标记领域，具体涉及一种高稳定性Halo-tag探针及其合成和生物应用。

背景技术

Halo-tag是目前应用最为广泛的标签蛋白之一，是来源于紫红红球菌中脱卤素酶的变异体，其能够与卤代脂肪烃类衍生物形成稳定的酯键。因此，携带有氯代脂肪烃的有机小分子荧光染料可以与Halo-tag发生特异性结合，达到对Halo-tag的稳定荧光标记。此外，由于Halo-tag并不是人源的酶经突变而来，故其在真核细胞内的特异性更高，细胞内非特异性标记几率很低，这也使其备受研究工作者的青睐，被用作融合蛋白来实时跟踪目标蛋白。

目前，Halo-tag探针通常由识别基团及荧光染料构成，其中识别基团均选择氯代己烷类衍生物，而荧光染料主要为荧光素类及罗丹明类染料。因此，荧光标记、成像等效果也主要就决定于荧光染料性能。荧光素类染料通常是含有氧负离子形式，容易被氧化，光稳定性差；罗丹明类染料则相反，为正离子盐形式，很容易在细胞内线粒体聚集造成荧光背景增高，信噪比降低。基于中性的荧光染料的Halo-tag探针仍然较少，且此类探针光稳定仍然存在问题，怎样提升此类探针稳定性、亮度仍然面临巨大困难。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种高稳定性Halo-tag探针，该探针能够实现活细胞内的免洗荧光成像。

本发明的另一目的是提供一种高稳定性Halo-tag探针的制备方法，该方法步骤简单、容易提纯、原料低廉等优点。

本发明一种高稳定性Halo-tag探针，通过在萘酰亚胺分子4,5-位引入环己二胺实现了荧光稳定性、亮度的大幅度提升，该探针分子在水中量子产率最高可达0.80，稳定性高于罗丹明、荧光素类染料。

一种高稳定性Halo-tag探针，该类Halo-tag荧光探针具有如下结：

一种高稳定性Halo-tag探针的合成方法，此系列荧光探针合成路线，如下：

具体合成步骤如下：

(1)中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(OAN-NBr)的合成：

将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐，二甘醇胺溶于无水乙醇中。将反应液加热至40-90℃，搅拌1-10h。将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝800:1-100:1为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(OAN-NBr)。(2)中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺(OAN-DAC)的合成：

将OAN-NBr，溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入环己二胺。将反应液缓慢升温至50-140℃，并在氮气保护下反应10-24h。减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝400:1-30:1为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体OAN-DAC。(3)Halo-tag探针(Halo-DAC)的合成