[发明专利]一种高稳定性Halo-tag探针及其合成和生物应用

权利要求书

1.一种高稳定性Halo-tag探针，其特征在于该探针以4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺为荧光基团，氯己烷为结合位点，其结构如下：

2.一种如权利要求1所述的高稳定性Halo-tag探针的合成方法，其特征包含步骤如下：

(1)中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺的合成：

将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐，二甘醇胺溶于无水乙醇中；将反应液加热至40-90℃，搅拌1-10h；将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为＝100～800:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺；

(2)中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺的合成：

将N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入环己二胺；将反应液缓慢升温至50-140℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为30～400:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺；

(3)Halo-tag探针的合成将N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺与NaH置于史莱克瓶中，并氮气置换2-5次；将1-碘-6-氯己烷溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，加入反应液中；室温下搅拌1-5h后，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为100～400:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得到靶向Halo-tag蛋白的荧光探针。

3.如权利要求2所述的一种高稳定性Halo-tag探针的合成方法，其特征在于：步骤(1)中：4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与二甘醇胺的质量比为1:1-3；

4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与无水乙醇的质量与体积比为1:40-120g/mL。

4.如权利要求2所述的一种高稳定性Halo-tag探针的合成方法，其特征在于：步骤(2)中，N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺与环己二胺的质量比为1:3-9；

N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺与乙二醇甲醚质量与体积比为1:200-600g/mL。

5.如权利要求2所述的一种高稳定性Halo-tag探针的合成方法，其特征在于：步骤(3)中，N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺与氢化钠(NaH)的质量比为1:0.36-1.08；

N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺与1-碘-6-氯己烷的质量与体积比为1:1-3g/mL；

N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺与N,N-二甲基甲酰胺的质量与体积比为1:100-300g/mL。

6.如权利要求1所述的一种高稳定性Halo-tag探针在细胞、组织及活体内的荧光成像的应用。

7.如权利要求1所述的一种高稳定性Halo-tag探针用于Halo-tag蛋白的识别与检测。

8.如权利要求1所述的一种高稳定性Halo-tag探针在单分子检测中的应用。

9.如权利要求1所述的一种高稳定性Halo-tag探针在STED及SIM超分辨成像中的应用。