[发明专利]固定化锌离子亲和层析材料及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种固定化锌离子亲和层析材料及其制备方法和应用，一种固定化锌离子亲和层析材料的制备方法，所述固定化锌离子亲和层析材料以琼脂糖为固相载体、亚氨基二乙酸为螯合剂，锌离子为配体，所述方法包括活化琼脂糖并螯合Zn²⁺，其中，活化琼脂糖的过程包括琼脂糖分子在NaBH₄‑NaOH溶液中接枝环氧基丙基，然后依次经蒸馏水、第一NaHCO₃‑Na₂CO₃缓冲液淋洗，并分别在第二NaHCO₃‑Na₂CO₃缓冲液和NaBH₄‑Na₂CO₃溶液中先后两次接枝‑N‑(CH₂COOH)₂基团。该方法接枝密度高、与Zn²⁺螯合效率高、Zn²⁺螯合量大，能够更有效地提取与锌离子有特异性结合的蛋白质。

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种固定化锌离子亲和层析材料及其制备方法和应用。

背景技术

锌元素是与动物生长、发育、繁殖、免疫、内分泌等的重要生理活动密切相关的一种金属元素，参与90多种酶的合成，与200多种酶的活性相关，直接参与核酸与蛋白质的合成、DNA的复制、细胞的分化增值、三大营养物质的代谢调节等重要生命过程，是动物体内必不可少的一种微量元素。对与锌离子有特异性结合的蛋白质进行定性、定量、相互作用等研究，对探索锌离子的生理作用及其与疾病的关系等具有重要价值。而对与锌离子有特异性结合的蛋白质进行分离提纯是其中的一个重要环节。近年来，固定化金属亲和层析法已经成为纯化蛋白的主要方法，在蛋白质的分离提纯中得到广泛应用。

固定化金属离子亲和层析又称金属螯合亲和层析，是一种新型快速发展的亲和层析分离技术，主要用于生物大分子的分离。与其他亲和层析技术相比，尤其是免疫亲和层析相比，固定化金属离子亲和层析更为稳定、吸附量大、条件温和、柱再生能力强、成本低。

1975年，Porach首次成功在琼脂糖上偶联了亚氨基二乙酸，再将Ni²⁺、Cu²⁺、Co²⁺等分别与IDA螯合形成螯合物分子，有较多方法试图改进该螯合物分子的结构，但是都往往存在方法复杂且IDA偶联密度较低、金属离子螯合量过少、且螯合效率低的缺陷，限制了其在蛋白质提取分子方面的应用。此外，不同金属离子的原子半径、中心原子外层d轨道、电荷数以及晶体场稳定化能各不相同，这些因素影响着螯合物分子与金属离子间的螯合效果以及进一步与金属蛋白质的螯合效果，影响了金属螯合亲和层析中金属元素的拓展和应用。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种固定化锌离子亲和层析材料及其制备方法和应用。琼脂糖是线性的多聚物，基本结构是1,3连结的β-D-半乳糖和1,4连结的3,6-内醚-L-半乳糖交替连接起来的长链。在对琼脂糖进行接枝的过程中，环氧基丙基会与琼脂糖的羟基连接，实现琼脂糖分子链的延伸，在该延伸的琼脂糖分子结构上二乙酸次氨基结构与环氧基结构相遇实现环氧基的开环聚合，进一步实现琼脂糖分子的延展与分子密度的增大。而在该过程中，延展的程度与分子密度增大的程度直接影响着琼脂糖分子的活化效果。而本发明的方法制备得到的亲和层析材料接枝密度高，与Zn²⁺螯合效率高，1小时螯合时间内的螯合率超过68％，Zn²⁺螯合量大，能够更有效地提取与锌离子有特异性结合的蛋白质。

本发明的目的在于提供一种固定化锌离子亲和层析材料及其制备方法，以及一种从细胞中提取与锌离子有特异性结合的蛋白质的方法。

具体地，本发明的上述目的是通过以下方案来实现的：