[发明专利]乳酸菌抗菌肽及高效表达及抗菌抗癌活性的应用

说明书

本发明涉及一种乳酸菌抗菌肽及高效表达及抗菌抗癌活性的应用，通过分析干酪乳杆菌(L.casei HZ1)的基因图谱，得到抗菌肽LHH1的基因序列，如序列1所示，模拟其二级结构，确定该肽的主要理化性质。依照乳酸菌密码子偏爱性优化并全合成LHH1基因，将该基因片段克隆到乳酸菌表达载体pE‑SUMO中，构建得到pE‑SUMO‑EA‑LHH1重组质粒。将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS中，对其进行诱导表达并分离纯化。本方法所获得的抗菌肽LHH1热稳定性强，有良好的抗菌、抗癌效果，可作为优良的防腐添加剂及发酵剂用于食品、药品、饲料等行业中。

技术领域

本发明涉及基因工程和生物技术领域，尤其是涉及一种新型乳酸菌抗菌肽 LHH1的高效表达及抗菌抗癌活性的应用。

背景技术

自上世纪90年代以来，对抗菌肽等新型抗菌物质的研究日益增加，其中防御素、富组蛋白(Histatin)等抗菌活性肽家族是人体免疫系统的天然成分，具有抗菌活性强、毒副作用小，耐药菌株少等优点，备受关注。抗菌肽在机体受到病毒、细菌等攻击时会被诱导产生，是动、植物和人类先天性免疫机制的组成部分，具有广谱抗菌作用，尤其对一些产生抗生素耐药性的病原菌，故而在农业、医疗、食品等多个领域应用潜力很大。

乳酸菌是一类以糖为原料产生乳酸的细菌，具有提高食品营养价值、改善食品风味、延长保存时间、对人畜安全无害，有保健功能的益生菌，因此被视为理想的蛋白多肽类物质的口服载体与表达载体。目前为止，已发现上千种天然抗菌肽，但其来源较复杂，安全指数待考究，因此，人们希望能从益生菌内探寻相关的抗菌肽，以保证其使用的安全性。

人们为了得到抗菌肽主要采用了三种方法：1.直接从生物体中提取天然肽； 2.化学方法合成；3.采用基因工程的方法。前两种由于成本过高，不适用于大规模生产，基因工程表达的方法越来越被大家所认可。先构建高效表达的发酵菌株，并建立其纯化和发酵的条件和方法，以便抗菌肽的生产推广和其在多方面的应用。

发明内容

本发明通过基因工程技术表达了一种来自干酪乳杆菌的新型抗菌肽LHH1，得到其高效表达的发酵菌株，并证实了LHH1的抗菌抗癌活性，以及在不同温度下LHH1的稳定性。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种新型乳酸菌抗菌肽，核苷酸序列见SEQ ID NO.1所示。

而且，所述抗菌肽的氨基酸序列、分子量、电荷数、等电点、疏水性分别为：AFALIAGALYRIFHRR，1875.25，+3，11.71，0.98。

一种新型乳酸菌抗菌肽的表达方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1.合成权利要求1所述的氨基酸序列，该序列为新型乳酸菌抗菌肽基因；

S2.构建含抗菌肽重组大肠杆菌基因工程菌；

S3.抗菌肽融合蛋白的诱导表达；

S4.抗菌肽的纯化。

而且，所述S1过程包括：根据干酪乳杆菌基因GenBank：(MOAG00000000.1) 并应用生物信息学工具计算各组合的一级特征参数、预测二级和抗菌活性，设计出具有医疗潜力的抗菌肽LHH1；根据大肠杆菌对密码子的偏爱性将抗菌肽的基因序列翻译成核酸序列，在其两端加上Bsa I和HindIII限制性内切酶位点和保护性碱基，合成引物F1、R1应用，所述引物的核苷酸序列如下SEQ ID NO.2 和SEQ ID NO.3。

而且，所述S2过程包括：构建抗菌肽表达质粒pE-SUMO-LHH1并测序鉴定，构建基因工程菌株pE-SUMO-EA-LHH1/Rosetta(DE3)pLysS并测序鉴定，所述测序鉴定SEQ ID NO.4，测序结果使用NCBI Blast与所设计的基因进行对比，选取两者结果一致的重组菌为测序结果正确的重组菌。