[发明专利]一种淀粉蔗糖酶突变体及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种淀粉蔗糖酶突变体及其制备方法与应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明将来源于Deinococcus Geothermalis的蔗糖淀粉酶第399位的甘氨酸突变为丝氨酸，所得淀粉蔗糖酶突变体应用于松二糖的生产。该淀粉蔗糖酶突变体在温度为35℃，初始pH为7.0的条件下得到了松二糖的产率达到32％，是野生酶生产松二糖转化率的2倍。因此，本发明的淀粉蔗糖酶突变体能够应用于松二糖的制备中，使松二糖的转化率得到进一步的提高。

技术领域

本发明涉及一种淀粉蔗糖酶突变体及其制备方法与应用，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

松二糖是由一分子葡萄糖和一分子果糖以α-1,3糖苷键连接形成的，其作为蔗糖的一种同分异构体，甜度仅为蔗糖的一半。它具有容易结晶、高度可溶、水解速率慢、易于与其他物质调和、不被致龋微生物发酵等特点，适于患有肥胖症、高血脂、高血压、糖尿病等人群食用。因此，在食品领域中松二糖具有成为新一代低热量的功能性甜味剂的潜力。此外，松二糖在医药领域也应用广泛，可作为酸性α-葡萄糖苷酶的抑制剂，用于庞贝氏病的医疗诊断；还具有消炎作用，可以抑制脂多糖与葡萄糖介导的炎症反应等，是一种具有高附加值的产品。

目前酶法制备松二糖的报道仅有两种。一种方法是以α-环糊精和果糖的混合物为底物，利用环糊精葡萄糖基转移酶合成松二糖，所得松二糖的最高产率可达为45％。但该法所利用的底物的成本较高且另需糖化处理。另一种方法是以蔗糖为底物，利用淀粉蔗糖酶直接将蔗糖异构化为松二糖，该法底物的成本较低、工艺更简洁。

淀粉蔗糖酶属于α-淀粉酶家族(GH13)，以蔗糖为天然底物，主要催化聚合和异构这两大转苷反应，而这两大转苷反应的发生依赖于初始蔗糖浓度。当蔗糖浓度较高时淀粉蔗糖酶会以催化异构反应为主，主要产物为松二糖；当蔗糖浓度较低时淀粉蔗糖酶则会以催化聚合反应为主，生成大量具有不溶性的α-1,4糖苷链及具有可溶性的麦芽低聚糖。因此，在松二糖的制备过程中，虽然聚合反应在一定程度上会被高浓度的蔗糖所抑制，但反应至蔗糖浓度减少时，聚合反应的发生还是会影响最终产物的产率。因此，获得一种聚合活性减弱的淀粉蔗糖酶突变体对于提高松二糖的转化率具有重要的工业应用潜力。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种催化异构化反应能力提升的淀粉蔗糖酶的突变体。

本发明通过将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的淀粉蔗糖酶第399位氨基酸由甘氨酸突变为丝氨酸，得到的淀粉蔗糖酶突变体，与亲本相比具有更高的松二糖转化效率。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉蔗糖酶的来源为中度嗜热菌(DeinococcusGeothermalis)。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉蔗糖酶突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种制备淀粉蔗糖酶突变体的方法，包括如下步骤：

(1)在淀粉蔗糖酶氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带淀粉蔗糖酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体的质粒载体；

(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；

(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，制备酶液。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉蔗糖酶的出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉蔗糖酶的来源为中度嗜热菌(DeinococcusGeothermalis)。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉蔗糖酶突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述质粒载体为pUC系列，pET系列，或pGEX中的任意一种。