[发明专利]一种脱细胞软骨基质及其制备方法

说明书

本发明涉及关节软骨技术领域，具体涉及一种脱细胞软骨基质及其制备方法，将软骨组织依次通过低渗处理、胰蛋白酶处理、去污剂处理和核酸酶处理，制得软骨基质，本发明制备的脱细胞软骨基质能够最大限度地保留软骨细胞基质本身的三维结构，具有良好的机械性能，而且不需要外加交联剂进行物理或者化学交联，免疫原性低、毒性低，而且制备方法简单，成本较低，适宜产业化生产。

技术领域

本发明涉及关节软骨技术领域，具体涉及一种脱细胞软骨基质及其制备方法。

背景技术

关节软骨是人体关节的重要结构，关节软骨的主要功能是保护骨骼关节面免受磨损。因关节软骨上无血管、淋巴和软骨分布，且软骨细胞高度分化，使得关节软骨自身修复能力极为有限，关节软骨一旦遭到破坏，产生的病理改变往往不可逆转，再生非常困难，而软骨损伤严重影响人的正常行走和日常活动，长期软骨损伤也是导致肢体残障的主要原因之一。

脱细胞技术是脱除免疫原性的组织细胞保留细胞外基质的方法，软骨的细胞外基质中不仅含有生物活性分子、胶原、非胶原糖蛋白、弹性蛋白、糖胺多糖等多种功能性成分，能够促进软骨组织修复，控制细胞的迁移、增殖、分化和代谢，而且由于软骨的细胞外基质为三维网状结构，有利于细胞的黏附、增殖，为细胞生长提供良好的生长环境，脱细胞技术已成为软骨组织修复中非常重要的研究方向和研究内容。

目前国内外常用到的脱细胞方法主要有机械法、酶消化法、化学去垢剂法等，然而在单独使用或者联合使用这些方法脱细胞的过程中容易出现细胞抗原性去除不彻底，细胞外基质的三维结构遭到破坏的问题，使得细胞营养供应以及代谢废物排出困难，影响软骨修复效果，甚至导致软骨修复失败。现有技术中，为了彻底地脱除软骨细胞，主要采用先将软骨粉粹或者研磨成微粒的方法，这就造成在后续处理中需要多次离心以及多次清洗，不仅加重了对细胞外基质的三维结构的破坏，导致脱细胞软骨基质材料力学性能变差、机械强度降低。

例如，中国专利文献CN108066823A公开了一种细胞脱细胞软骨基质的及其制备方法，具体包括如下步骤：(1)在低渗溶液中粉碎成软骨颗粒后以50-300rpm/min的速度震荡24-72h。(2)与离子表面活性剂在温度为37-40℃、转速为50-300rpm/min的条件下振荡3-6h得到第二软骨。(3)与胰酶以及核酸酶在温度为37-40℃、转速为50-300rpm/min的条件下振荡0.5-2h。(4)先在紫外线下照射1-3h后，再浸入交联剂中反应2-6h。上述脱细胞软骨基质的制备方法中，虽然通过物理和化学交联能够在很大程度上提高脱细胞软骨基质的力学强度，使其更加稳定，然而，因外加交联剂本身具有毒性及其残留的问题，植入体内一段时间后易出现免疫反应。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的脱细胞软骨基质机械性能差，免疫原性和毒性高的缺陷，从而提供一种脱细胞软骨基质及其制备方法。

本发明提供了一种脱细胞软骨基质的制备方法，将软骨组织依次通过低渗处理、胰蛋白酶处理、去污剂处理和核酸酶处理，制得软骨基质。

在低渗处理中，将软骨组织加入低渗溶液中孵育，室温下孵育15-30h；

优选地，所述低渗溶液为10mM且pH为7-8的Tris-Hcl溶液。

在胰蛋白酶处理中，将软骨组织加入胰蛋白酶溶液中，在37℃下水浴加热6-24h；

优选地，所述胰蛋白酶溶液为含0.10-0.50％(m/v)胰蛋白酶的PBS溶液。

在去污剂处理中，将软骨组织加入去污剂溶液中，在温度为15-25℃下振荡处理15-30h；

优选地，所述去污剂溶液为含0.05-0.3％SDS的8-10mM的Tris-Hcl溶液。