[发明专利]基于人工串联启动子的枯草芽孢杆菌高效诱导表达系统

说明书

本发明公开了基于人工串联启动子的枯草芽孢杆菌高效诱导表达系统，属于基因工程技术领域。本发明利用一种高效的人工串联组成型启动子，通过将该启动子与操纵子相关元件(阻遏蛋白及其结合位点)组合设计，进而使该组成型启动子的活性受到诱导剂的调控，最终构建出受诱导剂诱导的枯草芽孢杆菌高效诱导型表达系统。结果表明，与P43强组成型启动子相比，本系统中的人工串联启动子活性高出15倍左右。并且可以通过添加不同浓度的诱导剂精准控制启动子活性。因此本高效表达系统结构简单、活性高、调控严谨，在异源蛋白高效表达和合成生物学研究中有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及基于人工串联启动子的枯草芽孢杆菌高效诱导表达系统，属于基因工程技术领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌是广泛应用于表达外源蛋白的革兰氏阳性模式菌株，其因能够高效表达外源蛋白在工业酶制剂生产方面有广泛应用。启动子是构建高效表达系统的最基本的元件，启动子的活性直接决定了表达系统的效率。启动子从功能上主要分为组成型启动子和诱导型启动子两类。组成型启动子在菌体的生长各个阶段都可以表达外源基因，而诱导型启动子在没有被诱导时表现无活性或者低活性，在加入诱导剂之后启动子的活性大幅提高进而高效表达外源基因。诱导型启动子由于其活性可控而被广泛应用，人们可以通过调控加入诱导剂的试剂和浓度控制外源基因的表达时间和强度。目前在枯草芽孢杆菌当中应用较为广泛的主要有IPTG诱导系统和木糖诱导系统，其中，IPTG诱导系统主要基于pHT系列载体构建而成，使用的是非天然的杂合启动子和大肠杆菌的LacI阻遏蛋白和结合位点；而木糖诱导系统通常使用天然的PxylA启动子和XylR阻遏蛋白。

虽然IPTG、木糖等诱导系统已经广泛使用，但是由于启动子活性受限，外源蛋白的表达量低始终是限制系统应用的一个关键问题。人们通常采用改造天然启动子和重新设计人工启动子两种策略来提高启动子的活性和稳定性。但是高活性启动子往往无法用于构建高效诱导型外源基因表达系统，主要是由于启动子和基因表达调控系统的其他元件往往不兼容，高活性的启动子往往不能被阻遏蛋白有效地抑制活性。因此如何基于高效启动子构建严谨调控的诱导型外源基因表达系统是目前新型表达系统的开发热点。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种调控基因表达的元件，包括：(1)载体；(2)人工串联启动子；(3)阻遏蛋白基因；(4)位于启动子转录起始位点下游的能与阻遏蛋白结合的DNA片段；所述人工串联启动子包括P_AWH-D30-106、P_AH-D75-106或P_AH-D75-106，核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式，所述阻遏蛋白包括LacI、XylR、AraC或TetR。

在本发明的一种实施方式，所述阻遏蛋白为LacI时，基因表达受到IPTG的诱导作用。

在本发明的一种实施方式，所述阻遏蛋白为XylR时，基因表达受到木糖的诱导作用。

在本发明的一种实施方式，所述阻遏蛋白为AraC时，基因表达受到阿拉伯糖的诱导作用。

在本发明的一种实施方式，所述阻遏蛋白为TetR时，基因表达受到四环素的诱导作用。

在本发明的一种实施方式，所述载体包括pHT-01。

本发明的第二个目的是提供一种重组质粒，表达上述调节基因表达的元件

本发明的第三个目的是提供一种基因工程菌，表达上述重组质粒。

本发明的第四个目的是提供一种调控目的基因表达的方法，将上述调节基因表达的元件与目的基因共表达。

本发明的第五个目的是提供上述调控基因表达的元件在制备目的蛋白中的应用。

本发明的第六个目的是提供上述调控基因表达的元件在食品、化工或制药领域的应用。