[发明专利]一种DTE固定化纳米微球及其制备方法和基于其生产D-阿洛酮糖的方法

说明书

本发明公开了一种DTE固定化纳米微球及其制备方法和基于其生产D‑阿洛酮糖的方法，该方法构建了两株工程菌用于一步法合成DTE固定化纳米微球。首先采用基因融合的方法，将D‑塔格糖‑3‑差向异构酶基因(dte)通过一段linker融合到PHA合成酶基因(phaC)的5’末端上，得到dte‑linker‑phaC重组基因片段，并将此基因片段分别转化至食品级表达宿主L.lactis NZ9000和无内毒素污染的ClearColi中进行诱导表达，重组L.lactis或重组ClearColi细胞内就能合成表面带有DTE的PHA纳米微球，这样DTE就有效地结合到了纳米微球表面，形成固定化DTE，一步实现DTE的生产和固定化。

技术领域

本发明属于食品技术领域，涉及一种DTE固定化纳米微球及其制备方法和基于其生产D-阿洛酮糖的方法。

背景技术

D-阿洛酮糖是一种自然界存在极少的稀有糖，分类上属于己糖与酮糖，为D-果糖C3位所对应的差向异构体。D-阿洛酮糖的甜度相当于蔗糖的70％，能量只有蔗糖的0.3％，属于低热量的糖。同时，D-阿洛酮糖的口感干净、甜美，几乎与其它高卡路里的糖口味相当，且具有与蔗糖类似的功能属性(容积功能、胶凝性、美拉德反应特性等)，因此可以完全替代蔗糖添加到食品或饮料中。此外，研究表明，D-阿洛酮糖还具有调控血糖、降低血脂、减少腹部脂肪堆积、降低体重等生理功能，其独特的功能和潜在的医疗价值吸引了众多研究学者的关注。2011年，D-阿洛酮糖被美国FDA认定为公认安全(GRAS)的食品，允许其添加到食品中。自此D-阿洛酮糖得到了迅速发展，市场上出现了多种含D-阿洛酮糖的产品，它们作为特殊人群(如糖尿病患者、肥胖人群)的功能性食品在市场中受到广泛欢迎。

由于D-阿洛酮糖在自然界中含量极少，不易从自然界中提取；化学合成的方法又存在纯化步骤繁琐，化学污染严重，副产物杂多等问题，至今为止没有取得实质性进展。酶法合成因其具有反应单一、纯化步骤简单等优点，现以成为D-阿洛酮糖产业化研究的主要方向。D-塔格糖-3-差向异构酶(简称DTE)能将D-果糖差向异构化为D-阿洛酮糖，是D-阿洛酮糖生物转化的重要催化剂。

然而，游离的D-塔格糖-3-差向异构酶对环境温度和酸碱条件都极其敏感，容易失活；同时游离酶的纯化步骤复杂，成本高；且催化反应结束后，酶与底物以及产物不易分离，重复再利用率低等。这些问题都极大地限制了D-阿洛酮糖的产业化进程。因此，急需通过固定化酶技术，将游离酶固定在一定的载体上，以提高酶的稳定性，同时促进其连续生产，降低生产成本。

聚羟基脂肪酸酯(PHA)是微生物合成的一种胞内聚酯颗粒，球形，颗粒内部是聚酯链构成的疏水核心，外部是由各种PHA颗粒结合蛋白包被的亲水边界层。PHA合成酶PhaC是PHA颗粒合成的关键酶，通过共价键与PHA聚酯链相连，从而定位于PHA微球的表面。将酶蛋白与PhaC进行融合表达，可直接在重组微生物体内一步合成表面固定有酶蛋白的PHA纳米颗粒。由于纳米颗粒在微生物细胞内是以单独的包涵体形式存在，因此通过细胞破碎和离心的方法就能简便、有效地使其从细胞中分离并得到纯化。目前，该技术已成为一种高效、廉价的固定化酶新技术。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种DTE固定化纳米微球及其制备方法和基于其生产D-阿洛酮糖的方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种DTE固定化纳米微球，该DTE固定化纳米微球内部为疏水性高分子材料PHA；该DTE固定化纳米微球表面负载D-塔格糖-3-差向异构酶；

其中，D-塔格糖-3-差向异构酶的蛋白分子通过PHA合成酶PhaC固定到微球表面，PHA合成酶PhaC通过共价键与微球内部的疏水性高分子材料PHA相连。