[发明专利]一种DTE固定化纳米微球及其制备方法和基于其生产D-阿洛酮糖的方法

权利要求书

1.一种DTE固定化纳米微球，其特征在于，该DTE固定化纳米微球内部为疏水性高分子材料PHA；该DTE固定化纳米微球表面负载D-塔格糖-3-差向异构酶；

其中，D-塔格糖-3-差向异构酶的蛋白分子通过PHA合成酶PhaC固定到微球表面，PHA合成酶PhaC通过共价键与微球内部的疏水性高分子材料PHA相连；

D-塔格糖-3-差向异构酶的蛋白分子与微球表面的PHA合成酶PhaC构成DTE-PhaC融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；D-塔格糖-3-差向异构酶分子与PHA合成酶phaC之间的连接肽序列为G3SG3SG3SG3S；

该DTE固定化纳米微球的制备方法如下：

1)培养用于生产DTE固定化纳米微球的工程菌：重组大肠杆菌ClearColi BL21(DE3)pABC-DTE或乳酸菌Lactobacillus lactispNZ-ABC-DTE；

2)从培养得到的工程菌中分离提取DTE固定化纳米微球；

其中，所述重组大肠杆菌ClearColi BL21(DE3)pABC-DTE，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC No：M 2018788；

所述乳酸菌Lactobacillus lactispNZ-ABC-DTE，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC No：M 2018810。

2.根据权利要求1所述的DTE固定化纳米微球，其特征在于，所述疏水性高分子材料PHA由聚羟基丁酸酯、聚羟基辛酸酯、聚羟基癸酸酯、羟基丁酸-羟基戊酸共聚酯、羟基丁酸-羟基己酸共聚酯、羟基丁酸-羟基辛酸共聚酯和羟基丁酸-羟基戊酸-羟基己酸共聚酯中的一种或几种聚合而成。

3.权利要求1～2中任意一项所述的DTE固定化纳米微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)培养用于生产DTE固定化纳米微球的工程菌：重组大肠杆菌ClearColi BL21(DE3)pABC-DTE或乳酸菌Lactobacillus lactispNZ-ABC-DTE；

2)从培养得到的工程菌中分离提取DTE固定化纳米微球；

所述重组大肠杆菌ClearColi BL21(DE3)pABC-DTE，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC No：M 2018788；

所述乳酸菌Lactobacillus lactispNZ-ABC-DTE，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC No：M 2018810；

其中，该DTE固定化纳米微球内部为疏水性高分子材料PHA；该DTE固定化纳米微球表面负载D-塔格糖-3-差向异构酶；D-塔格糖-3-差向异构酶的蛋白分子通过PHA合成酶PhaC固定到微球表面，PHA合成酶PhaC通过共价键与微球内部的疏水性高分子材料PHA相连；D-塔格糖-3-差向异构酶的蛋白分子与微球表面的PHA合成酶PhaC构成DTE-PhaC融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；D-塔格糖-3-差向异构酶分子与PHA合成酶phaC之间的连接肽序列为G3SG3SG3SG3S。

4.根据权利要求3所述的DTE固定化纳米微球的制备方法，其特征在于，步骤2)中，从培养得到的重组大肠杆菌ClearColi BL21(DE3)pABC-DTE中分离提取DTE固定化纳米微球的操作包括：

将重组大肠杆菌ClearColi BL21(DE3)pABC-DTE培养获得种子液，按照2％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，并加入终浓度为10g/L的NaCl、终浓度为20g/L的葡萄糖和终浓度为75mg/L的Streptomycin，于30℃、200rpm培养4小时后再加入终浓度为1mM的IPTG诱导纳米微球的表达，继续摇床培养72小时后收集发酵液；

将发酵液高压均质处理后，去除细胞碎片及杂质，得到DTE固定化纳米微球，再经洗涤、冷冻干燥，得到DTE固定化纳米微球粉末。