[发明专利]百子莲SK3

说明书

本发明公开了一种百子莲SK₃脱水素蛋白在降低细胞胁迫伤害及改善超低温保存效果中的应用；此蛋白具有清除活性氧降低细胞胁迫伤害的能力，可有效改善细胞的冻后恢复生长率，明显提升超低温保存效率。具体方法是应用原核表达的方法富集纯化百子莲SK₃型脱水素蛋白(ApSK₃)，应用Fenton反应证明ApSK₃对ROS代谢的调控作用，利用植物超低温保存评价模型验证ApSK₃对植物细胞超低温保存的改善效果。具体包括：在超低温玻璃化溶液中添加2μmol/L ApSK₃蛋白，使植物冻后存活率提高了约1倍。本发明中公开的方法对清除活性氧、降低细胞胁迫伤害、提升细胞超低温保存冻后活性与保存效率优化显著。

技术领域

本发明涉及植物材料的保存领域，具体地，涉及一种百子莲SK₃脱水素蛋白在降低细胞胁迫伤害及改善超低温保存效果中的应用，可以降低植物细胞胁迫伤害，从而优化植物玻璃化超低温保存效果。

背景技术

玻璃化法超低温保存(Vitrification Cryopreservation)是指将植物种质资源用一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液(Plant VitrificationSolution,PVS)处理后，迅速投入液氮(-196℃)进行保存的一套低温生物学技术。将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液中，使材料及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下固化成非结晶的玻璃化态，并以这种玻璃态在低温下保存，达到长期保存种质的目的。超低温保存的材料占用空间小，无需额外的人工维护，能够避免细胞和组织的染色体数目因长期继代而发生的变化和离体材料在长期无性繁殖过程中可能造成的退化和病虫侵害，是近十年来用于优良种质资源中长期保存的首选方法。但在超低温保存过程中，植物组织或细胞也会面临严重的渗透脱水、ROS氧化胁迫、离子毒害、致命冰晶等多种胁迫伤害，会导致植物细胞的死亡。因此，通过外源保护类物质优化超低温保存体系，是保护植物材料提高保存效率的有效途径，对离体细胞中长期离体保存具有重要理论意义与应用价值，但常用的外源保护类物质(如VC、VE、GSH等)其功能主要是抗氧化，保护效果较为单一，不能较为全面的改善超低温复合逆境对细胞胁迫伤害。

拟南芥幼苗是植物超低温保存基础研究的重要材料。通过统计其冻后恢复生长率可以快速评价外源添加物质对植物材料的保护作用及超低温保存体系的优化效果。

脱水素(Dehydrin)属于细胞胚胎发育晚期丰度蛋白第二族(Late EmbryogenesisAbundant Proteins II,LEAII)，有着高亲水性、无序性和抗氧化性的特点。植物会在胚胎发育晚期以及胁迫应激反应下大量积累脱水素蛋白，以应对如干旱、高温和高盐等非生物胁迫环境。许多研究证实，植物脱水素具有防止蛋白变性、稳定质膜结构、结合过剩离子、缓解胁迫伤害等功能，是一类与植物细胞严重脱水密切相关的保护类蛋白。脱水素特殊的保护功能具有重要的应用潜力，但目前并没有在相关技术领域进行细胞体外开发应用。

发明内容

鉴于以上所述技术背景，本发明的目的在于提供SK₃脱水素在降低细胞胁迫伤害及改善超低温保存效果中的应用；本发明在获得百子莲脱水素蛋白ApSK₃编码基因的基础上，利用该蛋白具有热稳定性的特点与生物工程的方法，提供一种高效诱导并纯化 ApSK₃脱水素蛋白的方法，并将纯化后蛋白通过外源添加的方式应用于超低温保存体系领域，ApSK₃脱水素对于优化植物超低温保存技术具有安全性及广谱性作用，同时验证了ApSK₃能有效清除活性氧(reactive oxygen species,ROS)，减少保存过程中的氧化胁迫等伤害，对超低温过程中的植物材料具有明显的保护作用。本发明具体是提供一种具有抗氧化作用的蛋白，优化现有超低温保存技术体系，提升了植物材料的超低温保存效果，可以应用于植物种质资源的长期稳定保存。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：