[发明专利]百子莲SK3

权利要求书

1.一种用于植物玻璃化超低温保存的玻璃化溶液，其特征在于，所述玻璃化溶液为含有20-40% w/v丙三醇、10-20% w/v乙二醇、10-20% w/v二甲基亚砜、0.2-0.6mol/L蔗糖以及0.5-2 μmol/L 百子莲脱水素蛋白ApSK₃的MS培养液，所述百子莲脱水素蛋白ApSK₃是通过包含如下步骤的方法获得的：

A1、对表达脱水素蛋白ApSK₃的菌液进行诱导，对诱导后的菌液进行离心、清洗，得到悬浮菌液；

A2、对所述悬浮菌液进行煮沸裂解，冷却至室温后，离心收集上清液，即为纯化后的ApSK₃蛋白样品。

2.根据权利要求1所述的用于植物玻璃化超低温保存的玻璃化溶液，其特征在于，步骤A1中，获得所述表达脱水素蛋白ApSK₃的菌液的步骤包括：将含有ApSK₃重组质粒的Transetta菌种接种于LB液体培养基，在37 ℃，200 rpm的条件下大肠杆菌培养至生长对数中期，此时菌液OD₆₀₀=0.5-1.0；添加IPTG 至终浓度为0.2-0.5mM，在20-25 °C条件下诱导表达4~8 h。

3.根据权利要求1所述的用于植物玻璃化超低温保存的玻璃化溶液，其特征在于，步骤A2中，所述沸水浴处理的条件为：水温100℃，煮沸时间20-60min，煮沸期间每5-10min对离心管进行震荡混匀。

4.一种基于外源添加蛋白的植物玻璃化超低温保存方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、植物幼苗培养：对植物种子进行消毒、培养，取萌发36h-72h的植物幼苗；

S2、装载液处理：将植物幼苗置于装载液中进行浸泡处理；

S3、玻璃化溶液处理：将步骤S2处理后的植物幼苗置于权利要求1所述的玻璃化溶液中进行脱水处理；

S4、液氮保存：取出步骤S3处理后的植物幼苗迅速置于液氮中保存。

5.根据权利要求4所述的基于外源添加蛋白的植物玻璃化超低温保存方法，其特征在于，步骤S2中，所述装载液为含有2mol/L丙三醇和0.4mol/L蔗糖的MS培养液；所述浸泡处理的条件为：室温浸泡15-30min。

6.根据权利要求4所述的基于外源添加蛋白的植物玻璃化超低温保存方法，其特征在于，步骤S3中，所述脱水处理的条件为：在0-4°C条件下浸泡处理30-60min；

步骤S4中，所液氮中保存的时间为1h以上。

7.如权利要求4所述的基于外源添加蛋白的植物玻璃化超低温保存方法，其特征在于，还包括对超低温保存后的幼苗进行解冻、洗涤以及再培养的步骤；

所述解冻为在30-50 °C的水浴中解冻60-120 s；

所述洗涤采用的洗涤液为含有0.8-2.0 mol/L蔗糖的MS培养液；

所述再培养采用的恢复培养基为含有20-40 g/L蔗糖的MS固体培养基。