[发明专利]一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其制备方法和应用，属于分子生物学技术领域。所述脂肪酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.13所示。本发明通过多序列比对和二硫键预测结果，对米根霉脂肪酶ROL进行热稳定性改造，大幅度的提高了米根霉脂肪酶ROL的热稳定性，同时，借助计算机模拟技术，对热稳定性提高的原理进行了分子层面的解释。本发明提供的脂肪酶突变体的热稳定性显著提升，再结合其本身具备的高Sn‑1,3选择性，使其更具工业化应用价值。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种脂肪酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术

脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油 单酯或二酯。由于脂肪酶能催化一系列反应，在生物催化领域占据了重要的位置。迄今为止， 已经有多种脂肪酶实现了在工业生产中的价值，包括脂肪酶RML、CALB等。但是，也有许 多脂肪酶虽然在某些方面有独特的优势，但是由于其催化能力低下或者稳定性差，难以实现 大规模的应用，例如米根霉脂肪酶ROL(Rhizopus oryzae lipase)具有良好的1,3-位置特异性， 优先催化中长链脂肪酸，虽然具有很好的选择性，但是由于热稳定性差，极大地限制了它们 的使用。

为了提高酶的热稳定性，近年来，研究者们已经开发出多种方法，如固定化、介质工程 和蛋白质工程。与前两种方法相比，蛋白质工程更加理性化，能从本质上提高酶的热稳定性 且效果更佳，逐渐成为了热稳定性改造的主流方法。

蛋白质工程提高酶的热稳定性的方法包括非理性设计(定向进化)、半理性设计和理性设 计三种方法。如专利文献CN 101974499 A公开了一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，以华根 霉脂肪酶基因为模板，利用定向进化技术(易错PCR、DNA Shuffling和定点突变)获得了热稳 定性显著提高的脂肪酶突变体。

专利文献CN 102660517 A公开了一种运用半理性设计的方法对南极假丝酵母脂肪酶B 基因进行多轮定点饱和突变获得热稳定性提高的脂肪酶突变体，具体方法为：对南极假丝酵 母脂肪酶B基因的晶体结构进行分析，选取催化丝氨酸周围的氨基酸残基进行B因子分析， 确定B因子较高的残基作为饱和突变的热点，建立突变体库并筛选获得热稳定显著提高的突 变体。

理性设计是一种高效且省时的酶改造方法，被广泛应用于蛋白质工程中。理性设计借助 于计算机的计算，为酶改造提供了合理的改造方案，在很大的程度上减少了酶筛选的工作。 在理性设计的帮助下，许多酶获得性能强化的突变体。

因此，如何提高米根霉脂肪酶ROL的热稳定性是本领域技术人员需要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过热点突变和引入二硫键的方法，获得热稳定性进一步提 高的脂肪酶突变体。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种脂肪酶突变体的制备方法，包括以下步骤：

(1)筛选与米根霉脂肪酶(Rhizopus oryzae lipase)同源且具有热稳定性的氨基酸序列，通过 分析序列一致性，选择与同源序列不一致的氨基酸残基位点作为需要突变的位点；

(2)获取米根霉脂肪酶的晶体结构，通过在线网站Disulfide by Design 2分析潜在的二硫键 位置；

(3)结合步骤(1)和步骤(2)的分析结果，设计定点突变引物，以米根霉脂肪酶基因为模板， 进行定点突变，转化至宿主细胞，获得定点突变文库；

(4)从定点突变文库中筛选获得米根霉脂肪酶热稳定性提高的突变体。