[发明专利]长期携带乙型肝炎病毒的实验动物模型构建方法

说明书

本发明公开了一种长期携带乙型肝炎病毒的实验动物模型构建方法，包括如下步骤：1)提取乙型肝炎患者血清病毒DNA，使用引物对HBVF/HBVR进行PCR扩增；2)将PCR产物克隆到pEASY‑HBV载体中，挑选阳性克隆；3)提取阳性克隆的质粒，将提取到的质粒用BspQI内切酶酶切，回收酶切片段并纯化，用T4连接酶将其环化并纯化，得到HBV cccDNA；4)将cccDNA注射入小鼠中，构建乙型肝炎e抗原阴性小鼠模型。本发明通过一种简单、快速和方便的方法，成功的构建了一个能有效模拟HBV慢性感染的具有免疫活性的CBA/CaJ小鼠模型，HBsAg、HBeAg和HBcAg的表达均可长达26周。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种长期携带乙型肝炎病毒的实验动物模型构建方法。

背景技术

乙型病毒性肝炎由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起，该疾病是一个严重的全球公共卫生问题，可造成的临床症状多种多样，包括慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化(LC)和肝细胞癌(HCC)等。其中，慢性乙型肝炎，其乙肝病毒检测为阳性，病程超过半年或发病日期不明确而临床有慢性肝炎表现。据最新报道，世界上约有2.48亿人患有慢性乙肝。HBV在患者体内不易消除，导致病人对病毒有较高的发展成HCC的风险。基于HBV动物模型在乙型肝炎的发病机理和药物筛选研发中扮演中非常重要的角色。传统的HBV动物模型有黑猩猩、土拨鼠、树鼩、鸭等，在HBV感染研究中发挥着重要作用，传统模型有黑猩猩、土拨鼠、树鼩、鸭、树鼩等，他们在乙型肝炎病毒感染研究中发挥着重要作用。但是，黑猩猩模型成本较高，并且受伦理限制；土拨鼠和树鼩则表现为一过性的急性肝炎；虽然鸭肝炎产生的病理过程和愈后与人的乙型肝炎相似，现在广泛用于人的乙型肝炎研究的动物模型，但是鸭是鸭型肝炎病毒，与人的乙型肝炎病毒相差甚远，因而限制了其应用价值。所以，现有模型对于乙型肝炎的治疗研究都存在一定的局限性，特别是导致其无法用于CHB的治疗研究。因此，目前需要建立一个能够携带HBV时间长达26周(半年)的实验动物模型。

发明内容

本发明的目的针对上述问题提供一种长期携带乙型肝炎病毒的实验动物模型构建方法。

本发明实现其目的采用的技术方案是：

一种长期携带乙型肝炎病毒的实验动物模型构建方法，包括如下步骤：

1)提取乙型肝炎患者血清病毒DNA，使用引物对HBVF/HBVR进行PCR扩增，引物序列为：

HBVF：

5’-CCGGAAAGCTTATGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTARTCATC-3’，

HBVR：

5’-CCGGAGAGCTCATGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGGT-3’；

2)将获得的PCR产物克隆到pEASY-HBV载体中，挑选阳性克隆；

3)提取步骤2)中阳性克隆的质粒，将提取到的质粒用BspQI内切酶酶切，回收酶切片段并纯化，用T4连接酶将其环化并纯化，得到HBV cccDNA；

4)将步骤3)得到的HBV cccDNA注射入小鼠中，即构建了乙型肝炎e抗原阴性小鼠模型。

步骤4)中采用水动力法将HBV cccDNA注射入小鼠中。

每只小鼠的HBV cccDNA注射量为2μg/2mL/只。