[发明专利]一种干扰片段及其应用

权利要求书

1.一种干扰片段，其特征在于：用于干扰AQP1基因的转录水平，所述干扰片段的序列如下：

AQP1 RNAi-FP：5’-GCUGUACUCAUCUACGACUTT-3’；

AQP1 RNAi-RP：5’-AGUCGUAGAUGAGUACAGCTT-3’；

应用上述所述的干扰片段对AQP1基因进行RNA干扰的实验方法，

具体包括以下步骤：

(1)、设计好AQP1 siRNA序列，并设计对应的阴性对照siRNA；其中，

AQP1 RNAi-FP：5’-GCUGUACUCAUCUACGACUTT-3’，

AQP1 RNAi-RP：5’-AGUCGUAGAUGAGUACAGCTT-3’；

(2)、将AQP1 siRNA序列和阴性对照的RNAi干扰序列分装成1OD/管，使用前在3000-4000rpm，离心处理3min；然后加入125μL DEPC H₂O重悬，制备终浓度为20μM的储存液；

(3)、将人脐静脉内皮细胞使用完全培养基培养复苏后，经胰酶消化重新种植于6细胞培养板中；在37℃、5％CO₂培养过夜后，当镜检细胞在培养板中覆盖率达到85-90％时开始细胞转染处理；

(4)、细胞转染48小时后，使用1×PBS清洗细胞2次，然后使用Trizol试剂抽提转染细胞的总RNA；通过Nano-drop测定RNA含量，RNA OD260/280≈2.0；

(5)、使用RT-qPCR反转录试剂盒对总RNA进行反转录；

(6)、以步骤(5)中得到的反转录产物为模板，使用嵌合法qPCR用premix试剂，通过特异引物序列，以GAPDH内参基因引物对为对照，进行各细胞株AQP1表达的实时定量PCR检测，并按照2^-ΔΔCT分析各细胞株AQP1的相对表达量；

所述完全培养基为改良的完全培养基，培养基的配方为：MCDB131培养基+20％胎牛血清+50mg/mL内皮生长因子ECGS+100U/mL青霉素+50μg/mL肝素+2mmol谷氨酰胺+100U/mL链霉素。

2.权利要求1所述的干扰片段作为制备干扰AQP1基因的转录水平的药物的应用。

3.权利要求1所述的干扰片段作为制备减缓卵巢过度刺激综合征对应症状的药物、试剂盒的应用。

4.根据权利要求1所述的实验方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述细胞转染处理的具体步骤如下：

S1、配置转染试剂：

A：在90.0μL无血清OPTI-MEM培养基中添加2.0μL Lipofectamine 2000(Invotrigen)转染试剂，充分混匀室温静置5min；

B:分别在90.0μL无血清OPTI-MEM培养基中添加5.0μL待转染的AQP1 siRNA、DEPC水和阴性对照siRNA，充分混匀室温静置5min；

S2、将步骤A和B溶液混合均匀，在室温静置20min；

S3、将6细胞培养板中过夜培养基吸出，并用1×PBS清洗细胞2次；然后，每孔添加0.8mL无血清OPTI-MEM培养基；

S4、将S2中调整好的siRNA转染试剂复合物，分别滴到培养板中，37℃，5％CO₂培养6小时；

S5、去掉6细胞培养板中含转染试剂复合物的培养基，更换成新鲜的完全培养基继续培养人脐静脉内皮细胞24-48小时。

5.根据权利要求4所述的实验方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述反转录的体系如下：

1)去除基因组DNA反应：

其中，^＊1表示加入总量为1.0μg的总RNA

按照上述反应体系用量在冰上完成体系配置，并加入总量为1.0μg的总RNA，瞬时离心后，进行DNA消化反应；所述反应程序为：42℃保温2min；4℃保存；

2)反转录反应：

反应条件为：在冰浴中完成反应体系配置，使用移液枪轻柔混匀，瞬时离心后，进行反转录；反转录程序为：37℃反转录30min；85℃灭活反转录酶5S；4℃保存。